全自动生长曲线分析仪

A novel high-throughput screening method for identifying compounds that inhibit plasmid conjugation

一种用于筛选抑制质粒接合化合物的新型高通量方法

来源：MethodsX, Volume 12, Article ID 102740, 2024, 《MethodsX》, 第12卷, 文章编号 102740, 2024年, DOI:10.1016/j.mex.2024.102740

摘要

质粒接合是细菌间抗生素耐药基因水平传播的核心途径，加剧全球抗菌耐药危机，亟需能阻断接合转移的小分子抑制剂，但缺少低成本、快速的大规模化合物筛选手段。本文建立一套96孔板高通量筛选方案，以携带CTX-M-1接合质粒的大肠杆菌MG1655/pTF2为供体、利福平耐药大肠杆菌J53-2为受体，37℃共孵育1h后转种双抗选择性琼脂，通过菌落有无直观判断化合物对接合的抑制效果；实验设置接合阳性对照、苄基异硫氰酸酯抑制对照、单菌空白、培养基空白五组对照，对3500个小分子文库初筛，初筛得到62个活性化合物，复筛验证10个有效分子；为区分抑菌与专一接合抑制物，提出采用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长分析仪测定菌株生长曲线，同步搭配CFU计数排除化合物本身杀菌干扰，最终筛选出2个接合减弱、4个完全阻断的专一抑制剂。该方法操作简便、设备需求低，可适配任意接合质粒与宿主菌，为抗耐药传播先导化合物高通量挖掘提供标准化实验流程。

关键词

质粒接合；高通量筛选；接合抑制剂；大肠杆菌；耐药基因水平转移；化合物文库；Bioscreen C；生长曲线；接合转移；选择性琼脂筛选

研究目的

1. 构建低成本、易操作的96孔板高通量筛选体系，快速从数千小分子库中筛选质粒接合抑制化合物。

2. 完善完整对照体系，消除培养基、菌株、操作带来的假阳性干扰，提升初筛结果可靠性。

3. 建立配套验证方案，利用芬兰Bioscreen C测定细菌生长动力学，区分单纯抑菌化合物与专一接合抑制剂。

4. 验证该筛选方法通用性，适配不同宿主菌、不同类型接合可移动遗传元件。

5. 完成3500个化合物文库筛选，获得可专一阻断大肠杆菌IncI1型pTF2质粒接合的活性小分子。

研究思路

1. 筛选体系搭建：供体菌携带头孢噻肟耐药接合质粒，受体菌携带利福平染色体抗性，双抗琼脂仅接合子可生长；96孔板每孔添加化合物、供体、受体菌液，设置五类对照体系。

2. 初筛流程：37℃接合孵育1h，多通道移液器点样至选择性琼脂，过夜培养后肉眼观察菌落多少，判定接合抑制潜力。

3. 阳性复筛：初筛阳性化合物更换微孔板位置重复实验，排除孔位、孵育不均造成假阳性。

4. 活性区分验证：使用芬兰Bioscreen C连续测定有无化合物条件下供、受体菌OD生长曲线，结合CFU计数判断化合物是否仅抑制接合而非杀菌。

5. 方法通用性论证：提出该体系可更换菌株、质粒，用于各类接合型可移动元件抑制剂筛选。

研究亮点

1. 开发无需高端精密设备的高通量接合抑制剂筛选方法，成本低廉、通量高，单次可同步检测88个化合物。

2. 设计完整五级对照体系，有效规避实验环境、操作误差导致的假阳性，初筛复筛两步验证大幅提升筛选准确度。

3. 配套芬兰Bioscreen C全自动生长检测作为金标准验证手段，精准区分抑菌毒性与专一接合抑制活性，避免误筛杀菌类化合物。

4. 方法适用范围广，不受细菌种属、接合质粒类型限制，可拓展至各类耐药接合元件抑制剂挖掘。

5. 从3500个化合物中筛选得到6个无明显抑菌、专一阻断质粒接合的先导小分子，为抗耐药传播药物研发提供候选。

可延伸的方向

1. 基于本高通量体系扩大天然产物、药物重定位化合物文库筛选规模。

2. 结合Bioscreen定量接合效率，建立接合抑制半定量分级标准（完全抑制/部分减弱）。

3. 对6个阳性先导化合物开展细胞、动物体内实验，评估体内阻断耐药基因传播效果。

4. 改造筛选体系适配铜绿、克雷伯等临床多重耐药致病菌接合模型。

5. 联用转录组、蛋白组解析活性小分子抑制接合操纵子的分子靶点。

6. 优化孵育时间、药物浓度，进一步缩短整套筛选实验周期。

测量的数据及研究意义

1. 3500个化合物初筛、复筛菌落可视化琼脂成像图，数据来源正文图1，研究意义：直观区分接合完全抑制、接合减弱、无活性三类化合物，快速锁定候选小分子。

2. 初筛62个阳性、复筛10个有效化合物统计数据，研究意义：量化初筛假阳性比例，证明两轮复筛可显著提升筛选可信度。

3. 有无化合物条件下Bioscreen C细菌连续OD生长曲线，研究意义：定量判断化合物是否抑制细菌基础增殖，剔除杀菌假阳性候选物。

4. 不同化合物处理后细菌CFU活菌计数数据，配套Bioscreen联合验证，研究意义： 辅助佐证OD结果，确保生长曲线数值真实反映活菌数量，排除浊度干扰。

结论

1. 本研究建立的96孔板高通量接合抑制剂筛选方法操作简单、设备需求低，单次可批量检测大量小分子化合物，适配各类接合质粒与宿主细菌。

2. 完整设置五类实验对照，初筛后二次微孔复筛可大幅降低假阳性干扰，筛选结果稳定可靠。

3. 单纯菌落观察无法区分抑菌与接合抑制，必须搭配芬兰Bioscreen全自动生长分析仪测定生长曲线，结合CFU计数完成活性确证。

4. 对3500个小分子文库筛选后得到6个专一接合抑制剂，化合物不影响大肠杆菌基础生长，仅阻断pTF2质粒接合转移。

5. 该筛选平台可拓展至其他可移动遗传元件（转座子、整合子）抑制剂挖掘，为阻断耐药基因水平传播药物开发提供标准化筛选工具。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

1. 本研究将芬兰Bioscreen C作为配套标准验证设备，采用微孔高通量模式，同步设置空白菌液与加药平行组，37℃恒温自动定时采集OD浊度，长时间连续完整记录细菌全生长周期，全程自动化无需人工间断取样稀释，规避移液、温度、肉眼判读带来的系统误差。

2. 传统琼脂菌落只能终点定性，Bioscreen可动态捕捉完整增殖曲线，清晰区分“无生长（杀菌）”“生长正常（仅抑制接合）”两种截然不同表型，精准剔除具有细胞毒性的假阳性化合物。

3. 单块微孔板可同步完成数十种候选化合物的生长对照检测，大幅缩短复筛验证实验周期，节约菌株、培养基与小分子珍贵样品。

4. 仪器输出标准化时序OD数值，可直接导入统计软件计算生长速率、最大OD，定量评估化合物对细菌基础适合度的影响，结果客观可重复，方便批量横向对比所有候选分子。

5. Bioscreen生长动力学数据与琼脂接合筛选菌落成像、活菌CFU计数多层实验交叉印证，完整构建“高通量初筛—生长毒性验证—专一接合抑制剂确认”标准化完整筛选验证流程。