Three novel Enterobacter cloacae bacteriophages for therapeutic use from Ghanaian natural waters
源自加纳天然水体、可用于治疗的三株新型阴沟肠杆菌噬菌体
来源：Archives of Virology, Volume 169, Article number 156, 2024, 《病毒学档案》, 第169卷, 文章编号 156, 2024年, DOI:10.1007/s00705-024-06081-9
摘要
多重耐药阴沟肠杆菌复合体（ECC）感染全球发病率持续攀升，噬菌体疗法是替代抗生素的重要方案，但针对阴沟肠杆菌的噬菌体资源与系统研究十分匮乏。本研究开展加纳-芬兰联合试验，从当地即食食品中分离2株阴沟肠杆菌宿主菌，同时从加纳天然水体分离三株新型裂解性噬菌体fGh-Ecl01、fGh-Ecl04、fGh-Ecl02；完成三株噬菌体全基因组测序、分类学鉴定，利用芬兰Bioscreen FP-1100-C全自动微生物浊度仪开展宿主谱、噬菌体单用/美罗培南、环丙沙星、头孢吡肟联用杀菌动力学检测。基因组分析显示三株噬菌体均无整合酶、耐药、毒力基因，属于T4类长尾噬菌体，fGh-Ecl01/fGh-Ecl04归Karamvirus属，fGh-Ecl02归Agtrevirus属；宿主试验表明前两株可裂解61.1%芬兰临床阴沟肠杆菌分离株，后者仅覆盖7.4%；共培养动力学证实低浓度抗生素与噬菌体联用可完全抑制细菌生长，存在显著协同杀菌效应；单噬菌体处理后期易出现抗性菌，而噬菌体-抗生素组合可规避该缺陷。研究证明三株噬菌体具备临床治疗潜力，为多重耐药阴沟肠杆菌感染联合治疗提供新型生物材料。
关键词
阴沟肠杆菌；裂解性噬菌体；噬菌体疗法；基因组测序；宿主谱；抗生素协同；Bioscreen；多重耐药；T4类噬菌体；阴沟肠杆菌复合体
研究目的
1. 从加纳食品、天然水体分离阴沟肠杆菌宿主菌株与新型裂解噬菌体，完成三株噬菌体全基因组测序与生物信息学注释。
2. 基于Bioscreen仪器高通量浊度检测，系统测定三株噬菌体对芬兰临床阴沟肠杆菌的宿主裂解范围。
3. 单独噬菌体、不同浓度美罗培南/环丙沙星/头孢吡肟、噬菌体-抗生素联用三组对比，量化协同抑菌效果。
4. 解析三株噬菌体分类进化地位，评估基因组安全性（无溶原、耐药、毒力元件）。
5. 明确单噬菌体治疗局限性，验证噬菌体联合抗生素的抗感染优势，为临床联合疗法提供体外实验依据。
研究思路
1. 菌株与噬菌体分离：加纳街边即食蔬菜样品分离ECC宿主菌；校园灌溉池塘、河流水样富集纯化噬菌体，双层琼脂平板挑取单噬斑连续纯化。
2. 基因组表征：提取噬菌体DNA，二代测序组装，RAST、CARD、VirulenceFinder完成基因功能注释，VICTOR、VirClust构建全基因组、受体蛋白进化树。
3. 宿主谱筛选：收集55株芬兰临床阴沟肠杆菌及其他肠杆菌科菌株，Bioscreen连续15h检测OD600，依据浊度下降幅度划分强/中/弱裂解、无裂解等级。
4. 协同抑菌试验：设置高低两种抗生素浓度，分别单独、搭配对应噬菌体共培养，Bioscreen记录完整细菌生长曲线，对比各组增殖抑制差异。
5. 安全性与进化分析：核查基因组溶原、耐药、毒力相关基因；基于全基因组、尾丝受体蛋白序列系统发育分析噬菌体亲缘关系。
研究亮点
1. 首次从加纳自然水体分离三株无安全隐患的新型裂解性阴沟肠杆菌噬菌体，基因组不含整合酶、耐药、毒力基因，符合治疗用噬菌体筛选标准。
2. fGh-Ecl01、fGh-Ecl04宿主覆盖度高达61.1%，可适配多数临床阴沟肠杆菌感染场景，广谱优势突出。
3. 借助Bioscreen长时间动态生长监测，直观证明噬菌体与美罗培南、环丙沙星、头孢吡肟存在强效协同杀菌作用，极低抗生素剂量即可完全阻断细菌增殖。
4. 明确单独噬菌体处理会诱导细菌抗性产生，而噬菌体-抗生素联用可消除该缺陷，弥补单一噬菌体疗法短板。
5. 完成噬菌体精准分类，fGh-Ecl01/fGh-Ecl04为Karamvirus新株，fGh-Ecl02属于全新Agtrevirus物种，丰富肠杆菌噬菌体种质资源。
可延伸的方向
1. 构建三株噬菌体混合鸡尾酒制剂，扩大临床菌株裂解覆盖范围，降低抗性突变概率。
2. 开展小鼠腹腔/伤口多重耐药阴沟肠杆菌感染模型，验证噬菌体-抗生素联用体内治疗效果。
3. 改造噬菌体尾丝受体蛋白，靶向拓宽fGh-Ecl02宿主裂解谱。
4. 测试噬菌体在尿液、创面渗出液等临床基质中的稳定性与杀菌活性。
5. 长期传代试验，探究噬菌体-抗生素联用对细菌抗性进化的抑制机制。
6. 优化噬菌体规模化发酵纯化工艺，推进外用抗感染制剂开发。
测量的数据及研究意义
1. 噬菌体基因组基础信息、基因注释数据，数据来源表2，研究意义：明确三株噬菌体均为裂解型，无溶原、耐药、毒力相关基因，具备临床使用安全基础。
2. 全基因组、宿主识别蛋白系统发育进化树，数据来源图1，研究意义：厘清三株噬菌体分类地位与近缘物种，区分两类噬菌体基因组结构差异。
3. 55株临床菌株宿主裂解分级统计，数据来源表1，研究意义：量化三株噬菌体宿主覆盖差异，fGh-Ecl01、fGh-Ecl04广谱特性更适合临床应用。
4. Bioscreen检测宿主谱5h细菌浊度变化曲线，研究意义：标准化量化噬菌体裂解强度，建立浊度下降判定分级标准，实现宿主活性定量区分。
5. 单药、噬菌体、药-联用15h生长动力学曲线，数据来源图2，研究意义：直观证实单独噬菌体后期出现细菌复增，低浓度抗生素搭配噬菌体可永久抑制生长，协同效应显著。
结论
1. 从加纳水体分离得到fGh-Ecl01、fGh-Ecl04、fGh-Ecl02三株新型裂解性阴沟肠杆菌噬菌体，基因组安全无致病元件，分属Karamvirus、Agtrevirus两个病毒属。
2. fGh-Ecl01与fGh-Ecl04宿主广谱，可裂解61.1%芬兰临床阴沟肠杆菌分离株，fGh-Ecl02宿主范围狭窄仅覆盖7.4%目标菌株，三株均无法侵染大肠杆菌、克雷伯菌等其他肠杆菌。
3. 单用噬菌体培养体系400–900分钟后细菌会恢复增殖，易诱导噬菌体抗性；而低浓度美罗培南、环丙沙星、头孢吡肟搭配对应噬菌体可完全阻断细菌生长，二者存在强协同杀菌作用。
4. 进化分析显示fGh-Ecl01与fGh-Ecl04基因组相似度99%，为同一噬菌体物种；fGh-Ecl02同源性低，是全新噬菌体物种。
5. 三株噬菌体均可作为阴沟肠杆菌感染辅助治疗生物制剂，噬菌体联合抗生素是优于单一噬菌体的抗感染方案，为多重耐药阴沟肠杆菌临床治疗提供新思路。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 采用Bioscreen FP-1100-C高通量微孔检测平台，同步设置空白菌液、单抗生素、单噬菌体、噬菌体+抗生素多平行实验组，37℃持续振荡，设备每30分钟自动采集OD600浊度，最长连续监测15小时，全程密闭无菌，无需人工分次取样稀释，规避温度、移液、交叉污染、肉眼判读带来系统误差。
2. 区别平板终点噬斑计数静态结果，完整捕捉细菌迟滞、对数、稳定、复增全周期动态变化，清晰区分完全抑制、部分裂解、后期反弹三类表型，精准量化噬菌体与抗生素的协同增益幅度。
3. 一次性完成55株临床菌株、多种药物组合同步筛选，大幅缩短噬菌体宿主谱与协同药物筛选周期，节约细菌、噬菌体、抗生素实验耗材。
4. 仪器输出连续标准化时序OD数值，可直接导入Origin、SPSS开展统计学分析，消除肉眼区分浑浊度的主观偏差，裂解强弱、协同效果定量结果客观、可重复。
5. Bioscreen长时间生长动力学数据与基因组进化、宿主平板筛选多层次实验交叉印证，完整构建“噬菌体基因组特征—宿主裂解能力—抗生素协同杀菌”完整实验证据链。