Emergence and plasmid cointegration-based evolution of NDM-1-producing ST107 Citrobacter freundii high-risk resistant clone in China
中国产NDM-1 ST107高风险耐药弗劳地枸橼酸杆菌的出现及质粒共整合演化机制
来源：International Journal of Antimicrobial Agents, Volume 63, Article ID 107069, 2024,
《国际抗菌药物杂志》, 第63卷, 文章编号 107069, 2024年, DOI:10.1016/j.ijantimicag.2023.107069
摘要
耐碳青霉烯弗劳地枸橼酸杆菌（CRCF）给医院感染防控带来巨大压力，目前该菌流行病学特征与质粒动态演化研究尚不充分，ICU中新出现的高耐药克隆缺乏系统解析。本研究收集2017–2022年国内1060株枸橼酸杆菌，筛选得到20株CRCF，分型以ST22（30%）、ST107（25%）为主；其中一株ST107菌株同时携带tmexCD2-toprJ2替加环素耐药基因簇、blaNDM-1与blaKPC-2碳青霉烯耐药基因。全球系统发育分析显示ST107克隆包含5个国家人源与环境菌株，16株ST107中93.75%携带blaNDM-1或blaKPC-2。同一ICU两名患者分离的ST107菌株发生质粒融合，由Tn5403转座子、IS26介导插入缺失驱动；CF1807菌株内pCF1807-2携带blaNDM-1，pCF1807-3同时携带tmexCD2-toprJ2与blaKPC-2。接合实验证实共整合质粒pCF1807-2接合效率更高，连续传代稳定存在且不产生宿主适应性代价。研究证实ST107是可通过质粒共整合不断获得多重耐药基因的高风险克隆，需加强院内持续监测防止播散。
关键词
弗劳地枸橼酸杆菌；ST107克隆；耐碳青霉烯；blaNDM-1；blaKPC-2；tmexCD2-toprJ2；质粒共整合；接合转移；Bioscreen C；适应性代价
研究目的
1. 调查国内临床枸橼酸杆菌分离株中CRCF流行分布，明确主要序列分型克隆构成。
2. 解析国内新出现ST107高耐药克隆全球系统发育与分子流行特征。
3. 阐明同一ICU不同患者来源ST107菌株质粒融合、共整合演化分子机制。
4. 解析pCF1807-2、pCF1807-3两类多重耐药质粒骨架、耐药基因遗传环境。
5. 借助Bioscreen C测定接合子生长曲线，评估耐药质粒对宿主菌适应性代价。
6. 为ICU多重耐药弗劳地枸橼酸杆菌院内传播防控提供分子流行病学依据。
研究思路
1. 菌株分离与药敏检测：临床枸橼酸杆菌经MALDI-TOF鉴定，Vitek2初筛碳青霉烯耐药株，微量肉汤稀释法测定12种抗生素MIC。
2. 基因组测序与分型：20株CRCF开展二代测序，代表株联合长读长Nanopore测序；MLST分型，构建全球ST107与tmexCD阳性菌株系统发育树。
3. 质粒结构分析：BRIG、Easyfig、Circoletto完成质粒序列比对，解析Tn5403、IS26介导重组位点，绘制质粒演化路径。
4. 接合与稳定性实验：大肠杆菌J53作为受体，滤膜接合测定转移效率；无药连续传代10天验证质粒稳定性。
5. 菌株适应性检测：Bioscreen C高通量记录接合子24 h生长曲线，计算相对生长速率、曲线下面积AUC评估适应性代价。
6. 数据整合：结合临床ICU病房分离时序、质粒重组、生长适应性数据，阐述ST107克隆院内传播与耐药演化风险。
研究亮点
1. 首次报道国内同时携带blaNDM-1、blaKPC-2、tmexCD2-toprJ2三重耐药元件的ST107弗劳地枸橼酸杆菌。
2. 完整还原ICU内Tn5403、IS26介导两种质粒共整合形成高转移融合质粒的演化路径。
3. 证实融合质粒接合效率显著提升，且对宿主无生长适应性代价，极大利于院内持续传播。
4. 全球进化分析证明ST10克隆跨多国人/环境播散，属于高风险多重耐药克隆。
5. 利用Bioscreen C定量生长动力学，直观区分携带不同耐药质粒菌株的生长差异，明确质粒无适应性负担这一关键风险点。
可延伸的方向
1. 扩大全国多中心临床菌株采集，统计ST107克隆整体携带率与耐药基因谱。
2. 构建Tn5403、IS26敲除突变株，验证转座元件介导质粒重组的直接作用。
3. 探究pCF1807系列质粒跨肠杆菌科菌种接合传播能力。
4. 开展动物感染模型评估携带融合质粒菌株体内定植与致病能力。
5. 筛选可抑制质粒接合转移小分子抑制剂，阻断耐药基因水平传播。
6. 监测医院环境、污水中ST107环境株，追溯院内传播源头。
测量的数据及研究意义
1. 20株CRCF菌株12种抗生素MIC药敏数据表，数据来源表1，研究意义：明确ST107克隆对碳青霉烯、头孢、替加环素高度耐药，头孢地尔体外抑菌活性最优，为临床用药提供参考。
2. 20株CRCF系统发育树、全球ST107进化比对图，数据来源图1，研究意义：证明ST107克隆全球跨区域、跨宿主传播，具备广泛流行潜力。
3. ICU患者菌株分离时序、病房分布图，数据来源图2，研究意义：佐证ST107可在同一病区不同患者间交叉定植，存在院内暴发风险。
4. pCF1807-2、pCF1807-3质粒环形图谱、序列比对，数据来源图3、图4，研究意义：解析Tn5403介导质粒共整合、IS26介导片段缺失的分子重组特征，阐明多重耐药质粒形成机制。
5. 接合转移效率、质粒连续传代稳定性计数数据，研究意义：定量证实融合质粒转移效率显著高于原始质粒，且无抗生素压力下可稳定留存。
6. Bioscreen C测得接合子24 h生长曲线、相对生长速率、AUC面积，数据来源图5，研究意义：直观对比携带不同耐药质粒菌株生长状态，证实pCF1807-2不会降低宿主生长能力，解释该克隆易持续定植的核心原因。
结论
1. 20株耐碳青霉烯弗劳地枸橼酸杆菌主要分为ST22、ST107两大克隆，ST107为新出现高风险耐药谱系，全球多国均有人源、环境分离株。
2. 国内ICU同一病区两患者来源ST107菌株通过Tn5403转座子介导发生IncFII与IncA/C2质粒共整合，IS26介导大片段缺失形成融合质粒pCF1807-2。
3. pCF1807-2接合效率高于原始质粒，无药连续传代稳定存在，且不会给宿主带来生长适应性代价，利于菌株在医院环境持续存活传播。
4. 代表株内IncX5型质粒pCF1807-3同时携带双拷贝blaKPC-2与tmexCD2-toprJ2，兼具碳青霉烯、替加环高水平耐药能力。
5. ST107弗劳地枸橼酸杆菌可通过质粒重组不断累积多重耐药基因，属于院内高风险耐药克隆，需加强ICU微生物监测；头孢地尔可作为该类感染优选体外敏感药物。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 采用Bioscreen C 100孔蜂窝式高通量微孔培养体系，同步设置受体菌J53、携带不同质粒接合子多平行组别，37℃恒温持续振荡，设备每小时自动采集OD600浊度，连续完整记录细菌迟滞、对数、稳定全生长周期，全程密闭自动化，无需人工多次开盖取样，规避温度、移液、交叉污染、人工读数带来系统误差。
2. 区别终点单时间点菌落计数法，完整捕捉不同质粒菌株生长全程细微差异，清晰区分生长抑制、正常增殖两组表型，精准判定耐药质粒是否产生适应性代价。
3. 高通量并行检测一次性完成多株接合子生长测试，大幅缩短适应性评价实验周期，节约LB肉汤培养基耗材。
4. 仪器输出标准化连续时序OD数值，可直接导入GraphPad进行方差统计，消除肉眼判读菌液浑浊的主观偏差，生长速率、AUC定量结果客观可重复。
5. Bioscreen生长动力学数据与质粒接合效率、基因组重组、临床流行特征多层次结果交叉印证，完整构建“Tn5403介导质粒融合—高接合效率—无适应性代价—ST107院内传播”完整风险证据链。