Discovery of novel BfmR inhibitors restoring carbapenem susceptibility against carbapenemresistant Acinetobacter baumannii by structurebased virtual screening and biological evaluation
基于结构虚拟筛选与生物学验证发现可恢复耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌碳青霉烯敏感性的新型BfmR抑制剂
来源：Emerging Microbes & Infections, Volume 13, Article ID 2396877, 2024,《新发微生物与感染》，第13卷, 文章编号 2396877, 2024年, DOI:10.1080/22221751.2024.2396877
摘要
耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（CRAB）临床耐药问题严峻，BfmR是调控细菌毒力、抗生素耐药的双组分响应调控蛋白，是新型抗感染理想靶点。本研究以BfmR蛋白晶体结构为基础，搭建分层虚拟筛选流程，结合分子对接、分子动力学、MM/GBSA结合自由能计算筛选Specs化合物库，得到3个活性先导分子Cmp-86、Cmp-97、Cmp-98。体外实验证实三者均可降低美罗培南对CRAB菌株ZJ06的MIC；其中Cmp-98作用与BfmR敲除株效果相近，可下调K荚膜合成基因。芬兰Bioscreen C生长曲线监测显示抑制剂联合美罗培南可显著抑制菌株增殖；扫描电镜观察抑制剂处理后菌体形态出现皱缩、畸形等损伤。分子动力学模拟证明3个小分子均可动态结合BfmR磷酸化位点周边新型抑制结合凹槽，通过干扰蛋白磷酸化、二聚阻断下游毒力基因转录。该研究提供全新骨架BfmR抑制剂，为开发针对CRAB新型抗菌药物提供新思路。
关键词
BfmR；双组分系统；耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌；虚拟筛选；分子动力学；美罗培南增敏；生物膜；Bioscreen C；抑菌协同；等温滴定量热
研究目的
1. 以BfmR蛋白晶体结构构建精准虚拟筛选模型，从大型Specs化合物库筛选潜在抑制小分子。
2. 借助Bioscreen C动态生长监测，验证候选分子单用、联合美罗培南对CRAB的增殖抑制协同效果。
3. 体外多重生化实验验证候选分子抗生物膜、损伤菌体、下调毒力基因活性。
4. 通过分子对接、长时间分子动力学解析小分子与BfmR磷酸化凹槽结合模式，阐明抑制分子机制。
5. 利用ITC等温滴定量热验证小分子与BfmR蛋白直接结合亲和力。
6. 筛选可恢复碳青霉烯类药物敏感性的BfmR抑制剂，为多重耐药鲍曼不动杆菌感染提供新型佐剂先导物。
研究思路
1. 蛋白构象建模：选取BfmR晶体结构，以已知配体模拟得到抑制态最优蛋白构象，搭建虚拟筛选模板。
2. 分层虚拟筛选：Glide初筛→MM/GBSA重打分→类药五规则过滤→分子聚类，获得206个候选化合物。
3. 初筛杀菌实验：化合物与美罗培南联用孵育CRAB，平板涂布筛选具备增敏活性的3个先导分子。
4. 生长动力学检测：Bioscreen C设置多浓度单用/联用组别，20 h连续测定OD600绘制生长曲线，棋盘法计算FIC协同指数。
5. 体外功能验证：扫描电镜观察菌体形态；结晶紫定量生物膜；RT-qPCR检测荚膜、群体感应相关毒基因表达；CCK8评价对人肺上皮细胞毒性。
6. 分子机制解析：分子对接+100 μs长时间分子动力学模拟，分析配体动态结合凹槽；ITC测定蛋白结合平衡常数。
研究亮点
1. 建立基于BfmR抑制态构象分层虚拟筛选体系，从20万级化合物库筛选出3个全新骨架高效BfmR抑制剂。
2. 采用芬兰Bioscreen C高通量动态监测，直观量化抑制剂与美罗培南协同抑菌效应，明确三者均具备中度协同作用。
3. 首次揭示BfmR磷酸化位点旁存在新型抑制结合凹槽，小分子结合后干扰蛋白二聚、阻断毒力基因转录。
4. Cmp-98兼具下调荚膜基因、抑制成熟生物膜双重活性，体外细胞毒性较低，具备药物开发潜力。
5. 整合计算模拟+多层次体外生物学验证，完整阐明抑制剂逆转CRAB碳青霉烯耐药的分子通路。
可延伸的方向
1. 基于Cmp-98骨架开展分子优化，提升与BfmR结合亲和力，降低有效作用浓度。
2. 构建CRAB小鼠肺部/伤口感染模型，开展体内增敏药效与长期毒理评价。
3. 探究抑制剂与多类碳青霉烯、多粘菌素等临床抗生素联用广谱协同效果。
4. 构建bfmR基因敲除回补菌株，直接验证小分子靶点特异性。
5. 开发医用敷料、冲洗液制剂，用于医疗器械表面CRAB生物膜防控。
6. 扩大菌株测试，评估抑制剂对临床多重耐药鲍曼不动杆菌分离株的普适增敏能力。
测量的数据及研究意义
1. 虚拟筛选分子对接、分子动力学结合自由能、蛋白结合位点聚类数据，数据来源图1，研究意义：确立BfmR抑制态最优筛选构象，明确磷酸化区、二聚界面两大结合口袋，为后续分子改造提供结构依据。
2. Bioscreen C 20 h细菌生长曲线、棋盘法FIC指数，数据来源图2，研究意义：直观对比单用抗生素、单用抑制剂、联用三组生长差异，定量证明Cmp-86/Cmp-97/Cmp-98均可中度协同美罗培南抑制CRAB增殖。
3. 扫描电镜菌体形貌图像，数据来源图3，研究意义：证实抑制剂可破坏鲍曼不动杆菌正常杆状形态，联用后菌体损伤程度显著加剧。
4. 结晶紫生物膜定量吸光度，数据来源图4，研究意义：亚抑菌浓度Cmp-98可显著抑制生物膜生成，其余两个分子无明显抗膜效果，区分分子功能差异。
5. RT-qPCR毒力基因相对表达量，研究意义： 阐明Cmp-98特异性下调荚膜合成关键gnaA、galU基因，从转录层面阻断细菌毒力表达。
6. 分子对接、长时动力学结合构象与ΔG数据，数据来源图5、6、7、8，研究意义：解析小分子动态结合A-B激活凹槽、B-C抑制凹槽的差异模式，解释Cmp-98更强抑制活性的结构基础。
7. ITC等温滴定量热结合常数，研究意义：体外直接证实3个先导分子均可与BfmR蛋白稳定结合，明确分子靶点相互作用真实存在。
8. A549细胞CCK8存活率IC50数据，研究意义：证明先导分子有效抑菌浓度下细胞毒性可控，具备后续制剂开发安全基础。
结论
1. 依托BfmR抑制态蛋白构象完成分层虚拟筛选，得到Cmp-86、Cmp-97、Cmp-98三个新型骨架小分子抑制剂。
2. 三个分子均可与美罗培南产生中度协同抑菌作用，显著抑制CRAB菌株增殖，其中Cmp-98可下调荚膜合成基因、强效抑制生物膜形成。
3. 机制上小分子结合BfmR磷酸化区域B-C抑制凹槽，阻碍蛋白磷酸化与二聚，抑制下游荚膜、群体感应毒力基因转录，逆转碳青霉烯耐药。
4. 分子动力学证明配体可在激活、抑制凹槽间动态转换，凹槽结合自由能差值决定抑制强弱，Cmp-98抑制活性最优。
5. ITC实验证实小分子与BfmR存在直接稳定相互作用，体外人肺上皮细胞毒性可控，可作为抗生素增敏佐剂先导化合物，用于耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌感染新药开发。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 采用Bioscreen C 100孔高通量微孔检测平台，同步设置空白对照、单用美罗培南、单用抑制剂、不同浓度联用多平行组别，37℃恒温持续振荡，设备自动定时采集OD600，连续20 h完整记录细菌迟滞、对数、稳定全生长周期，全程密闭自动化操作，无需人工反复开盖取样，规避温度波动、移液操作、交叉污染、人工读数带来系统误差。
2. 区别平板终点活菌计数单一静态结果，完整捕捉不同给药组细菌增殖全过程细微差异，清晰区分轻微延缓、显著抑制、近乎完全阻断三种药效梯度，精准测算协同作用区间，直观体现小分子增敏效果。
3. 高通量一次性完成多菌株、多浓度、多组合同步检测，大幅缩短抑制剂协同活性筛选周期，微量肉汤体系节约珍贵先导化合物样品用量。
4. 仪器输出标准化时序OD数值，可直接导入GraphPad、SPSS开展方差与协同指数统计，消除肉眼判读菌液浑浊程度的主观偏差，抑菌定量结果客观、重复性高。
5. Bioscreen生长动力学数据与电镜形态、生物膜定量、基因转录、分子模拟、ITC蛋白结合多层次实验交叉印证，完整构建“小分子结合BfmR—抑制毒力基因—协同碳青霉烯抑制CRAB增殖”完整证据链。