Atomically dispersed nanozyme-based synergistic mild photothermal/nanocatalytic therapy for eradicating multidrug-resistant bacteria and accelerating infected wound healing
基于原子分散纳米酶的协同温和光热-纳米催化疗法用于清除多重耐药菌并促进感染创面愈合
来源：RSC Advances, Volume 14, Pages 7157-7171, 2024,《RSC进展》, 第14卷, 页码7157-7171, 2024年, DOI:10.1039/d3ra08431k
摘要
多重耐药菌（MRSA）感染创面临床缺乏高效无耐药治疗手段，单一光热或纳米催化疗法抗菌效果有限。本研究通过MOF高温热解法制备氮掺杂碳纳米片负载铜锰双原子纳米酶（Cu/Mn-DSAzymes），该材料兼具类过氧化氢酶（CAT）、类氧化酶（OXD）双酶活性与近红外二区（NIR-II）光热性能；搭配96孔全自动微生物生长分析仪（Bioscreen C）记录大肠杆菌、MRSA生长曲线，结合材料理化表征、体外抗菌、细胞相容性、小鼠感染创面体内实验开展系统验证。机制上Cu⁺位点催化生成超氧阴离子杀菌，Mn⁴⁺分解低浓度H₂O₂产氧，NIR-II温和升温可同步提升双酶催化效率，光热与纳米催化存在显著协同效应。体外实验证实协同处理可完全清除浮游菌与成熟生物膜，破坏细菌细胞膜、泄漏胞内核酸与离子；细胞实验证明材料低细胞毒性，催化产氧可促进成纤维细胞迁移；小鼠MRSA感染创面模型显示协同疗法大幅降低创面细菌载量，下调促炎M1巨噬细胞、上调修复型M2巨噬细胞，促进胶原沉积与血管新生，显著加速创面修复。该双模态协同纳米酶体系为多重耐药菌感染创面提供安全高效新型治疗策略。
关键词
铜锰双原子纳米酶；氮掺杂碳纳米片；类酶催化；近红外二区温和光热；协同抗菌；MRSA；生物膜；创面愈合；Bioscreen C；巨噬细胞极化
研究目的
1. 制备兼具CAT/OXD双类酶活性与NIR-II光热性能Cu/Mn双原子纳米酶，完成材料微观结构、元素配位、光热与催化性能全面表征。
2. 借助Bioscreen C动态监测不同处理组MRSA、大肠杆菌生长曲线，量化单一/协同疗法对细菌增殖抑制能力。
3. 阐明纳米酶光热协同双重杀菌分子机制，验证其破坏细菌细胞膜、清除生物膜效果。
4. 评价Cu/Mn-DSAzymes对成纤维细胞、红细胞的生物相容性，探究产氧对细胞迁移修复作用。
5. 构建MRSA全层皮肤感染小鼠模型，验证体内协同抗菌、抗炎及促创面再生修复效果。
6. 建立集纳米催化、温和光热于一体的双模态抗感染纳米平台，用于耐药菌创面治疗。
研究思路
1. 材料合成与表征：Cu/Mn-BTC金属有机框架为前驱体，双氰胺氮源800℃高温热解制备Cu/Mn-DSAzymes；通过TEM、AC-HAADF-STEM、XAS、XPS等表征原子分散状态与配位结构；测试紫外吸收、升温曲线、光热转换效率、CAT/OXD酶动力学参数。
2. 体外抗菌筛选：设置空白、单独光热、单独纳米酶、光热+纳米酶多组处理，Bioscreen C测定600nm浊度生长曲线；平板菌落计数、活死菌共聚焦、SEM观测菌体形态；检测K⁺、β-半乳糖苷、核酸泄漏量解析膜损伤机制；结晶紫与共聚焦评价抗生物膜能力。
3. 细胞相容性实验：CCK-8检测不同浓度纳米酶对L929成纤维细胞活力；溶血实验评估血液安全性；RDPP氧探针、划痕实验验证材料产氧促细胞迁移作用。
4. 体内动物实验：小鼠背部构建MRSA全层感染创面，分组给药并辅以NIR-II光照；记录9天创面愈合面积、创面菌落数；脏器H&E染色评价全身毒性；创面组织H&E、Masson、CD86/CD206/CD31免疫荧光分析炎症、胶原、血管新生。
5. 机制整合：串联材料催化光热协同、体外杀菌、体内抗炎修复多层次数据，完整阐述纳米酶双模态创面治疗通路。
研究亮点
1. 一步热解法制备Cu/Mn双原子共分散纳米酶，Cu⁺、Mn⁴⁺位点分工实现级联催化，同时具备优异NIR-II温和光热转化能力。
2. 采用Bioscreen C高通量连续记录细菌完整生长周期，直观量化光热+纳米酶协同增殖抑制优势，区分单一组与联合组抗菌差异。
3. 协同疗法兼具强效杀菌、清除生物膜双重效果，温和升温不损伤正常组织，规避高温灼伤风险。
4. 催化产氧可调控巨噬细胞向修复表型极化，同步促进胶原沉积与血管新生，实现抗菌+创面组织重塑双重功能。
5. 体内实验证实无明显脏器毒性，生物安全性良好，具备外用抗感染敷料开发潜力。
可延伸的方向
1. 修饰纳米酶表面靶向多肽，实现细菌特异性富集，进一步降低给药剂量。
2. 复合水凝胶、微针载体，制备可外用创面缓释制剂，提升临床适用性。
3. 拓展对铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等其他多重耐药菌的抗菌测试。
4. 结合多组学解析纳米酶作用后细菌全局代谢与应激通路变化。
5. 开展糖尿病慢性感染创面小鼠模型，验证缺氧环境下治疗效果。
6. 优化热解制备工艺，实现规模化量产并储存稳定性测试。
测量的数据及研究意义
1. Cu/Mn-DSAzymes微观形貌、元素分布、X射线吸收、XPS谱图表征数据，数据来源图1，研究意义：证实Cu、Mn金属原子均匀单分散于氮碳基底，明确Cu-N、Mn-N配位结构，解释双类酶活性来源。
2. 材料紫外吸收、不同浓度/功率升温曲线、光热循环稳定性、CAT/OXD酶动力学数据，数据来源图2，研究意义：证明材料NIR-II吸收优良，光热转换效率38.7%，双酶催化存在光热增强效应，确定体外标准处理浓度与激光参数。
3. Bioscreen C测得各组MRSA、大肠杆菌24h OD600生长曲线，数据来源图3e、3f，研究意义：直观显示仅光热+纳米酶联合组可完全阻断细菌增殖，单一组仅轻度延缓生长，定量协同抗菌增益效果。
4. 菌落计数、活死菌荧光、细菌SEM、胞内大分子泄漏检测数据，数据来源图3、图4，研究意义：证实协同处理严重破坏细菌细胞膜，造成核酸、钾离子、酶大量外泄，彻底杀灭浮游菌并清除成熟生物膜。
5. L929细胞活力、溶血率、细胞产氧与迁移实验数据，数据来源图5，研究意义：说明纳米酶体外细胞、血液毒性极低，催化产氧可改善缺氧微环境，促进成纤维细胞增殖迁移。
6. 小鼠创面温度、愈合面积、创面活菌计数、脏器病理切片数据，数据来源图6，研究意义：体内验证协同疗法温和控温、显著清除创面耐药菌，无肝肾心脾肺器官损伤，全身安全。
7. 创面H&E、Masson三色、巨噬细胞与血管免疫荧光定量数据，数据来源图7，研究意义：阐明协同处理抑制M1促炎巨噬细胞，诱导M2修复型巨噬细胞，加速胶原沉积与新生血管生成，缩短创面愈合周期。
结论
1. 成功合成氮掺杂碳纳米片负载Cu/Mn双原子纳米酶，Cu⁺介导OXD产杀菌超氧阴离子，Mn⁴⁺介导CAT分解H₂O₂产修复氧气，NIR-II光照可显著提升双酶催化效率，光热与纳米催化存在强协同作用。
2. 体外Bioscreen生长曲线、菌落与电镜实验证明Cu/Mn-DSAzymes联合NIR-II温和光热可完全抑制MRSA、大肠杆菌增殖，严重破坏细菌细胞膜结构，高效清除成熟生物膜。
3. 该纳米酶生物相容性优异，无明显细胞溶血毒性，催化产氧可促进成纤维细胞迁移，改善创面缺氧微环境。
4. MRSA感染小鼠体内实验表明，光热-纳米催化协同疗法可大幅降低创面细菌载量，减轻局部炎症反应，调控巨噬细胞修复极化，促进胶原沉积与血管新生，9天创面愈合率显著提升。
5. Cu/Mn双原子纳米酶协同温和光热疗法是多重耐药菌感染创面安全、高效的新型双模态治疗策略，在皮肤抗感染敷料领域具备良好应用前景。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 采用Bioscreen C配套96孔高通量微孔培养体系，一次性设置空白、单独纳米酶、单独NIR光热、纳米酶+光热多平行实验组，37℃恒温持续振荡，设备每小时自动采集OD600浊度，连续完整记录细菌迟滞期、对数期、稳定期全过程，全程密闭自动化，无需人工多次开盖取样，规避温度、移液、交叉污染、人工读数带来系统误差。
2. 区别平板终点菌落计数单一静态结果，完整捕捉不同处理组细菌增殖全程细微差异，清晰区分轻微生长延迟、部分抑制、完全杀灭三种药效梯度，直观体现光热与纳米酶的协同增益效应。
3. 高通量并行检测大幅缩短多组抗菌活性筛选实验周期，微量LB肉汤体系节约珍贵双原子纳米酶样品用量，降低实验耗材成本。
4. 仪器输出标准化连续时序OD数值，可直接导入GraphPad、SPSS开展方差统计，消除肉眼判读菌液浑浊程度的主观偏差，细菌抑制强弱定量结果客观、可重复。
5. Bioscreen动态生长动力学数据与材料光热催化表征、体外膜损伤、细胞相容性、体内创面修复多层次实验交叉印证，完整构建“Cu/Mn双原子纳米酶—光热增强级联催化—协同杀灭耐药菌—促创面修复”完整实验证据链。