Evaluation of Antibacterial Activity of Thiourea Derivative TD4 against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus via Destroying the NAD+/NADH Homeostasis
通过破坏NAD+/NADH稳态评价硫脲衍生物TD4对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性
来源：Molecules, Volume 28, Article ID 3219, 2023, 《分子》，第28卷，文章编号3219，2023年，DOI:10.3390/molecules28073219
摘要
本研究合成8种硫脲衍生物并筛选抗菌活性，化合物TD4抑菌效果最优。体外实验显示TD4对多种金黄色葡萄球菌（含MRSA、VISA）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、粪肠球菌均具备强效抑制作用，MIC为2–16 μg/mL，对革兰氏阴性菌无抑制效果。采用芬兰Bioscreen C设备测定细菌生长曲线，TD4呈浓度依赖性抑制MRSA增殖；时间杀菌实验显示4倍MIC浓度处理4 h可大幅降低活菌数量。电镜观测证实TD4会破坏MR细胞壁完整性、造成胞内容物外泄。转录组、qPCR结果表明TD4显著下调乙醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶等关键代谢基因，打破NAD+/NADH氧化还原稳态。细胞毒性实验显示有效抑菌浓度范围内TD对人内皮、白血病细胞无明显损伤；ADMET预测符合Lipinski、Veber类药规则。小鼠MRSA皮肤感染模型体内实验证实TD4可缩小感染病灶、降低组织载菌、减轻炎症浸润。整体表明TD4是靶向NAD+/NADH平衡、兼具体内外抗MRSA活性的先导化合物。
关键词
硫脲衍生物；TD4；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；MRSA；NAD+/NADH稳态；抗菌活性；Bioscreen C；生长曲线；转录组；皮肤感染模型
研究目的
1. 合成一系列硫脲衍生物，筛选对多重耐药革兰阳性菌活性最优分子TD4。
2. 利用Bioscreen C测定梯度TD4处理下MRSA完整生长曲线，量化体外抑菌浓度效应。
3. 通过电镜观察TD4对MRSA细胞形态、细胞壁结构的破坏作用。
4. 借助转录组测序结合qPCR，解析TD4干扰细菌NAD+/NADH平衡的分子代谢机制。
5. 评价TD4细胞毒性、理化成药属性，评估药物开发潜力。
6. 构建MRSA小鼠皮肤感染模型，验证TD4体内抗感染、抗炎治疗效果。
研究思路
1. 有机合成：以异硫氰酸酯与各类伯胺一步反应合成8种硫脲衍生物TD1–TD4、TD5–TD8。
2. 体外抑菌筛选：微量肉汤稀释法测定全部化合物对标准、临床耐药菌株MIC，筛选最优分子TD4。
3. 生长动力学检测：芬兰Bioscreen C全自动分析仪每10 min读取OD600，连续24 h记录不同倍数MIC下菌株生长曲线。
4. 杀菌时效实验：梯度TD4处理不同时长，平板计数活菌，绘制时间杀菌曲线。
5. 形态机制观测：扫描、透射电镜观察TD4处理后细菌细胞壁破损、胞质泄漏特征。
6. 转录组与分子验证：对照组与TD4处理组RNA测序，筛选差异代谢基因；qPCR验证adhE、alD等基因表达变化，检测胞内NAD+/NADH比值。
7. 安全性与成药性：CCK8检测人源细胞活力；在线工具计算LogP、氢键供受体等参数，匹配类药规则。
8. 体内药效：构建BALB/c小鼠皮下MRSA感染模型，腹腔给药后观测皮损大小、组织活菌与病理炎症变化。
研究亮点
1. 筛选得到新型硫脲小分子TD4，仅靶向革兰阳性耐药菌，对革兰阴性菌无作用，抑菌选择性突出。
2. 采用Bioscreen C长时动态监测，完整捕捉MRSA全生长周期抑制差异，直观呈现浓度依赖性抑菌特征。
3. 首次阐明TD4抗菌核心机制：下调丙氨酸脱氢酶等代谢基因，破坏NAD+/NADH氧化还原稳态，同时瓦解细菌细胞壁结构。
4. 体外低细胞毒性，理化性质符合口服药物成药标准，体内可有效治愈MRSA皮肤软组织感染。
5. 相比苯唑、头孢等临床耐药抗生素，TD4对多重耐药MRSA菌株仍保持极低MIC，具备抗耐药菌开发价值。
可延伸的方向
1. 修饰TD4侧链结构，进一步降低MIC、拓宽抑菌谱至革兰阴性耐药菌。
2. 开展TD4与临床抗生素协同抑菌实验，筛选联合用药配比。
3. 开展大鼠长期重复给药毒理、体内药代动力学实验。
4. 优化制剂，开发外用凝胶、口服制剂用于皮肤感染治疗。
5. 探究TD4对MRSA生物膜形成的抑制作用。
6. 基于NAD代谢通路，挖掘同类型新型硫脲先导分子。
测量的数据及研究意义
1. 8种硫脲衍生物对各菌株MIC数据表，数据来源表1、表2，研究意义：明确TD4对MRSA、VISA、耐药表皮葡萄球菌、粪肠球菌MIC仅2–16 μg，显著优于其余衍生物与耐药抗生素，确定核心先导分子。
2. Bioscreen C连续24 h细菌生长OD曲线，数据来源图1，研究意义：直观体现1/2×、1×、2×、4× MIC梯度下对菌株增殖的逐级抑制效果，为体外药效定量提供连续动力学依据。
3. 时间杀菌菌落计数曲线，数据来源图2，研究意义：证实4倍MIC浓度短时间内快速清除MRSA活菌，证明TD4兼具抑菌、杀菌双重活性。
4. 扫描电镜、透射电镜细菌形貌图像，数据来源图3、图4，研究意义：直观观察TD4造成细胞壁破损、胞内容物流失，明确细胞结构损伤是重要杀菌途径。
5. 转录组差异基因散点图、KEGG通路富集，数据来源图7、图8、表3，研究意义：锁定糖、氨基酸氧化代谢通路为主要扰动靶点，定位adhE、alD等关键调控基因。
6. qPCR基因表达、NAD+/NADH比值检测数据，数据来源图9，研究意义：从转录与代谢水平验证TD4打破细菌氧化还原稳态，阐明完整分子作用机制。
7. CCK8细胞活力、ADMET类药参数，数据来源图6，研究意义：证明有效抑菌剂量下无细胞毒性，分子理化指标满足口服药物开发标准。
8. 小鼠皮损面积、组织载菌、病理切片，数据来源图5，研究意义：体内层面证实TD4可减轻MRSA感染炎症、降低组织细菌负荷，具备活体治疗效果。
结论
1. 8种硫脲衍生物中TD4抗菌活性最优，选择性抑制MRSA、VISA、耐药表皮葡萄球菌、粪肠球菌等革兰阳性耐药菌，对革兰阴性菌无抑菌效果。
2. Bioscreen C生长动力学实验证明TD4呈浓度依赖性阻断MRSA增殖，4×MIC处理4 h可显著降低活菌数量。
3. TD4双重杀菌机制：一是破坏MRSA细胞壁结构引发菌体裂解；二下调adhE、alD等代谢基因，扰乱NAD+/NADH氧化还原稳态，阻断能量代谢。
4. TD4在有效抑菌浓度范围内对人内皮、白血病细胞毒性极低，分子理化性质符合Lipinski与Veber成药规则。
5. 小鼠MRSA皮肤感染模型中，TD4可显著缩小感染病灶、减少组织活菌、抑制炎症细胞浸润，体内抗感染疗效明确。
6. 硫脲衍生物TD4是新型抗MRSA先导化合物，可用于后续抗耐药皮肤感染药物开发。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 采用Bioscreen C蜂窝微孔体系，同步设置空白对照、多梯度TD4浓度、多株耐药菌株，37℃恒温每10 min自动采集OD600，24 h不间断完整记录细菌迟滞期、对数期、稳定期全过程，全程密闭无需人工开盖移液，规避温度、污染、人为读数误差。
2. 区别单点终点MIC肉眼判读，动态生长曲线可清晰区分轻微生长延迟、完全抑制两个药效层级，精准划分各浓度抑菌强弱梯度。
3. 高通量一次性完成多菌株、多浓度平行检测，大幅缩短硫脲衍生物抑菌筛选周期，微量肉汤体系节约有机小分子样品。
4. 仪器输出标准化时序OD数值，可直接导入统计软件做方差分析，消除人工肉眼主观偏差，浓度-抑菌效应结论客观可重复。
5. Bioscreen生长动力学定量结果与杀菌时效、电镜形态、转录组代谢、体内动物药效多层次实验交叉印证，完整构建“TD4浓度—细菌增殖抑制—细胞壁损伤—NAD代谢紊乱—体内抗感染”完整证据链。