Enhancement of Fluoride’s Antibacterial and Antibiofilm Effects against Oral Staphylococcus aureus by the Urea Derivative BPU
尿素衍生物BPU增强氟化物对口腔金黄色葡萄球菌的抗菌及抗生物膜作用
来源：Antibiotics, Volume 13, Article number 930, 2024, 《抗生素》，第13卷，文章编号930，2024年，DOI:10.3390/antibiotics13100930
摘要
口腔是金黄色葡萄球菌重要定植储存库，该菌可引发多种颌面部感染，常规氟化物对金黄色葡萄球菌抑制效果有限，难以清除成熟生物膜。本研究合成二芳基尿素衍生物BPU，通过棋盘稀释、时间杀菌、芬兰Bioscreen C细菌生长曲线检测、透射电镜、分子对接、基因过表达等实验证实BPU与氟化钠（NaF存在显著协同抗菌、抗生物膜效果。机制上BPU可结合细菌氟离子外排蛋白CrcB1/CrcB，阻断胞内氟离子外流，提升胞内氟蓄积量，持续抑制细菌代谢、破坏细胞膜。单独NaF抑菌浓度高，BPU联用可大幅降低氟使用剂量；联用体系能显著降低浮游菌活菌数，完全抑制生物膜基质生成与活菌增殖。细胞毒性实验显示有效作用浓度下BPU对人牙龈成纤维细胞无损伤，生物安全性良好。该研究提出BPU-氟化物复配新策略，为口腔金黄色葡萄球菌相关感染提供安全高效防治方案。
关键词
氟化钠；尿素衍生物BPU；金黄色葡萄球菌；口腔感染；协同抗菌；抗生物膜；氟离子通道；CrcB转运蛋白；Bioscreen C；牙龈成纤维细胞
研究目的
1. 探究尿素衍生物BPU与氟化钠联用对口腔金黄色葡萄球菌的协同抑菌、抗生物膜活性。
2. 利用芬兰Bioscreen C全自动微生物检测仪测定不同处理组细菌生长动力学，定量联用增效作用。
3. 阐明BPU作用靶点为氟外排蛋白CrcB1/CrcB，揭示阻断氟外流、胞内氟蓄积的分子机制。
4. 通过分子对接、基因过表达菌株验证BPU与转运蛋白结合及功能调控关系。
5. 评价BPU对人牙龈成纤维细胞的体外细胞毒性，评估口腔应用安全性。
6. 为口腔含漱剂、牙周护理产品开发提供新型低剂量氟增效活性配方。
研究思路
1. 化合物筛选与制备：合成多种二芳基尿素衍生物，棋盘微量稀释法筛选与NaF存在协同作用的BPU，计算FICI协同指数。
2. 浮游菌生长动力学检测：采用芬兰Bioscreen C仪器，设置空白、单独NaF、单独BPU、复配多梯度组别，37℃每小时测OD600，连续监测细菌24h生长。
3. 杀菌动力学与超微观察：时间杀菌实验统计不同时长活菌CFU；透射电镜观察各组细菌细胞壁、胞质损伤差异。
4. 生物膜评价：结晶紫定量生物膜总量，共聚焦激光显微镜区分死活菌与胞外基质。
5. 分子机制验证：分子对接模拟BPU与CrcB二聚体结合模式；构建crcB1&2过表达金黄色葡萄球菌，对比药物敏感性变化；离子色谱测定胞内氟离子含量。
6. 细胞安全实验：CCK8法检测梯度BPU处理后人牙龈成纤维细胞活力，显微镜观察细胞形态。
研究亮点
1. 首次证实二芳基尿素BPU可作为氟化物增效剂，二者协同指数FICI=0.375，具备强协同抗菌抗生物膜效果。
2. 明确全新作用靶点：BPU特异性结合氟外排蛋白CrcB1/CrcB，抑制氟外流、提升胞内氟蓄积，放大氟的细菌毒性。
3. 借助Bioscreen C高通量长时生长监测，直观证明复配体系可完全阻滞细菌对数增殖，单一组仅产生微弱抑制。
4. 联用方案大幅降低氟使用浓度，在有效抑菌剂量下对牙龈细胞无细胞毒性，解决高氟牙釉质损伤、氟斑牙风险。
5. 复配制剂同时清除浮游金黄色葡萄球菌与成熟生物膜，适配牙周炎、种植体周围炎、口腔溃疡等多种生物膜相关感染。
可延伸的方向
1. 开展小鼠口腔感染体内实验，验证BPU-NaF复配体内抗感染疗效与黏膜刺激性。
2. 改造BPU分子结构，提升与CrcB蛋白结合亲和力，进一步降低有效作用浓度。
3. 将复配活性物添加至漱口水、牙膏，开展配方稳定性与感官优化研究。
4. 拓展测试口腔混合致病菌（变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌）协同抑菌效果。
5. 探究长期使用BPU是否诱导金黄色葡萄球菌产生氟耐药突变。
6. 基于Bioscreen平台高通量筛选其他与氟协同的小分子增效剂。
测量的数据及研究意义
1. 棋盘稀释FICI协同指数、各组MIC数值，数据来源表1，研究意义：定量判定BPU与NaF存在显著协同作用，确定最优联用配比，为后续动力学实验提供浓度依据。
2. Bioscreen C连续24h细菌OD生长曲线，数据来源正文材料方法生长动力学部分、图1，研究意义：直观显示单独NaF、BPU仅延缓细菌生长，复配组完全阻断增殖，从动态层面证实协同抑菌优势。
3. 时间杀菌实验CFU活菌计数、透射电镜细菌超微图像，数据来源图2，研究意义：复配组2h内几乎完全杀灭浮游菌，细菌细胞壁大面积破损、胞质渗漏，直观体现联用杀菌强度。
4. 结晶紫OD570、共聚焦生物膜荧光定量数据，数据来源图4，研究意义：复配处理后生物膜总量大幅下降，活菌比例显著降低，证实可抑制生物膜成型与成熟。
5. 分子对接结合能、crcB过表达菌株生长曲线、胞内氟离子色谱定量，数据来源图5、图6，研究意义： 明确BPU稳定结合CrcB转运蛋白，过表达菌株对复配体系耐受性上升，胞内氟含量显著提升，完整阐明作用机制。
6. CCK8细胞活力、细胞显微形态数据，数据来源图7，研究意义：有效抗菌浓度范围内BPU无牙龈细胞毒性，证明口腔局部应用安全窗口宽。
结论
1. 尿素衍生物BPU与氟化钠联用具有强协同抗口腔金黄色葡萄球菌活性，协同指数0.375，可大幅降低氟使用剂量。
2. BPU可结合细菌氟外排转运蛋白CrcB1/CrcB，阻断氟离子外流，提升胞内氟蓄积，增强氟对细菌代谢与细胞膜破坏毒性。
3. 相比单独氟或单独BPU，复配体系既能高效清除浮游金黄色葡萄球菌，又可显著抑制成熟生物膜生成。
4. 过表达crcB1&2基因会削弱复配药物抑菌效果，直接验证CrcB为BPU核心作用靶点。
5. 有效作用浓度下BPU对人牙龈成纤维细胞无明显细胞毒性，口腔局部使用生物安全性良好。
6. BPU-NaF复配体系是极具潜力的口腔抗感染活性组合，可用于漱口水、牙周护理产品开发，用于金黄色葡萄球菌相关口腔疾病防治。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 采用Bioscreen C蜂窝微孔高通量检测体系，同步设置空白、单独药物、多梯度复配平行组别，37℃恒温持续振荡，每小时自动采集OD600，连续24h完整记录细菌全生长周期，全程密闭无需人工分次开盖取样，规避温度波动、移液、交叉污染带来实验误差。
2. 区别单一终点抑菌圈或单点吸光度检测，可区分轻微迟滞、部分抑制、完全阻断增殖三种不同药效等级，精准量化协同增效幅度。
3. 一次性完成全部浓度梯度平行检测，大幅缩短抑菌活性初筛实验周期，微量肉汤体系节约氟化物与BPU珍贵样品。
4. 仪器输出标准化时序OD数据，可直接导入统计软件做方差分析，消除肉眼判读主观偏差，协同抑菌结论定量客观、可重复。
5. Bioscreen生长动力学数据与杀菌曲线、生物膜定量、分子对接、基因过表达多层次实验交叉印证，完整构建“BPU结合CrcB→胞内氟蓄积→协同抑制浮游菌与生物膜”完整证据链。