Preparation and Biological Activity of Lignin–Silver Hybrid Nanoparticles
木质素-银杂化纳米颗粒的制备及其生物活性研究
来源：ACS Omega, Volume 9, Pages 47765–47787, 2024, 《ACS欧米伽》，第9卷，页码47765–47787，2024年，DOI:10.1021/acsomega.4c08117
摘要
银纳米颗粒（AgNPs）是高效抗菌材料，但传统化学制备工艺污染大、能耗高，游离银纳米颗粒胶体稳定性差、易大量析出银离子，存在环境与生物安全隐患。本研究以有机溶胶法桦木木质素为原料，透析溶剂交换法制备木质素纳米颗粒LigNPs，其粒径中位数256 nm，圆形度0.985，表面褶皱富集还原性酚羟基，可同时充当还原剂与稳定剂原位负载银纳米颗粒；优化反应体系，在银/木质素质量比0.25、pH11条件下银负载量最高，得到杂化纳米材料AgLigNPs。材料表征证实银为面心立方晶型，木质素骨架可抑制银离子泄漏。选用三株铜绿假单胞菌开展体外抗菌实验，采用Bioscreen C仪器测定浮游菌生长曲线，80/9.5 mg/L木质素-银浓度下可完全抑制浮游菌增殖，同时生物膜形成量下降50%；相比游离银纳米颗粒，同等抗菌效果下AgLigNPs银用量降低2–8倍。培养基稳定性测试显示LB、TSB细菌培养基中材料轻微团聚，但纳米颗粒结构完整；DMEM细胞培养液中分散稳定。细胞实验选用HEK-293人肾细胞、HaCaT皮肤角质细胞，安全浓度下材料无明显细胞毒性，具备生物医用开发潜力。
关键词
木质素；银杂化纳米颗粒；绿色合成；铜绿假单胞菌；浮游菌；生物膜；抗菌活性；银离子缓释；细胞相容性；Bioscreen C
研究目的
1. 对比反溶剂沉淀、酸沉淀、透析溶剂交换三种工艺，筛选形貌稳定的木质素纳米颗粒制备方法。
2. 优化pH、银/木质素投料比，构建木质素原位还原负载银的绿色合成体系AgLigNPs。
3. 借助芬兰Bioscreen C高通量微生物检测仪定量AgLigNPs对铜绿假单胞菌浮游菌生长抑制能力，测定MIC。
4. 评价材料对铜绿假单胞菌生物膜清除效果，对比游离AgNPs的银用量差异。
5. 考察材料在细菌、细胞培养基中的胶体稳定性与银离子释放规律。
6. 通过两种人体细胞系评估材料体外细胞安全性，论证医用敷料、创面抗菌应用潜力。
研究思路
1. 木质素纳米颗粒制备：有机溶胶桦木木质素分别采用三种工艺制备，DLS、SEM、FTIR表征粒径、球形度、表面官能团，筛选透析溶剂交换法作为最优方案。
2. AgLigNPs合成与表征：不同pH、银木质配比原位还原制备杂化颗粒，AAS测银负载量；TEM、XR、UV-vis、Zeta电位表征银粒径、晶型与胶体稳定性。
3. 培养基稳定性实验：LB、TSB、DMEM+胎牛血清体系37℃孵育48 h，定时测粒径、紫外吸收、透析法测银释放量。
4. 浮游菌生长动力学：梯度浓度AgLigNPs、游离AgNPs加入铜绿假单胞菌菌液，Bioscreen C 37℃连续24 h监测OD600生长曲线，确定最低抑菌浓度。
5. 生物膜抑制实验：96孔板培养铜绿假单胞菌生物膜，MTT法测定生物膜代谢活性，量化抑制效率。
6. 细胞毒性实验：梯度浓度材料处理HEK-293、HaCaT细胞，Resazurin法测细胞代谢活力，显微镜观察细胞形态变化。
研究亮点
1. 生物质木质素一步绿色原位合成银杂化纳米材料，无需额外有毒还原剂，工艺低碳环保。
2. 木质素载体有效束缚银纳米颗粒，大幅降低银离子泄漏，同等抗菌效果下银投加量显著低于游离AgNPs。
3. 采用Bioscreen C长时动态监测细菌全周期生长，精准量化材料抑菌剂量效应，直观区分完全抑制与部分迟滞生长。
4. 材料同时抑制铜绿假单胞菌浮游菌增殖与生物膜成型，对创面感染两大污染形态均有作用。
5. 在细菌培养液轻微团聚但结构完整，细胞培养液分散稳定，安全浓度下无皮肤、肾细胞毒性，适合医用抗菌敷料开发。
可延伸的方向
1. 改性木质素表面官能团，进一步提升银负载量、降低银离子释放速率。
2. 将AgLigNPs复合壳聚糖、海藻酸钠制备抗菌水凝胶、创面敷料，开展动物创面感染实验。
3. 拓展多重耐药革兰阴性、阳性菌抑菌筛选，评估广谱抗菌潜力。
4. 利用Bioscreen平台开展材料与抗生素协同抑菌高通量筛选。
5. 长期细胞慢性毒性、皮肤刺激性动物实验，完善医用安全评价数据。
6. 开发食品接触面、水产养殖水体长效抗菌纳米制剂。
测量的数据及研究意义
1. 三种制备工艺木质素纳米颗粒DLS、SEM、FTIR数据，数据来源图1、图2、图5，研究意义：透析溶剂交换法制备颗粒球形度最高、碱性环境稳定，表面富集酚羟基，为高效原位还原银离子提供结构基础。
2. 不同pH、银配比Ag负载AAS定量、TEM/XRD图谱，数据来源图6、图7，研究意义：确定pH11、mAg:mLig=0.25为最优合成条件，该配比下银纳米均匀负载于木质素表面，结晶完整。
3. 不同培养基48 h粒径、紫外、银释放数据，数据来源图8、图11，研究意义：细菌培养基材料轻微聚集但骨架不分解，细胞培养液分散稳定，仅微量银释放，解释低生物毒性机制。
4. Bioscreen C铜绿假单胞菌24 h生长曲线、MIC数值，数据来源图12，研究意义： 80/9.5 mg/L可完全抑制浮游菌增殖，同等抑菌效果银用量仅为游离AgNPs 1/2–1/8，证明木质素协同增效作用。
5. MTT生物膜代谢定量数据，数据来源图13，研究意义：该浓度下铜绿生物膜活性下降50%，材料可同时抑制浮游菌与固着生物膜，适配创面复杂感染环境。
6. HEK-293、HaCaT细胞活力与显微图像，研究意义：抗菌有效浓度下细胞存活率无显著下降，材料对表皮、肾脏细胞低毒，具备人体外用安全基础。
结论
1. 透析溶剂交换法可制备粒径256 nm、高球形度木质素纳米颗粒，表面酚羟基兼具还原与稳定银纳米双重功能，实现无外源还原剂绿色合成AgLigNPs。
2. pH11、银木质素质量比0.25条件下银负载效率最高，木质素骨架有效限制银离子溶出，降低潜在生物与环境毒性。
3. 经Bioscreen生长动力学验证，80/9.5 mg/L AgLigNPs可完全抑制铜绿假单胞菌浮游菌生长，同等抗菌活性所需银剂量远低于游离银纳米颗粒。
4. AgLigNPs可降低50%铜绿假单胞菌生物膜代谢活性，对浮游、生物膜两种感染形态均具备抑制效果。
5. 材料在细胞培养液胶体稳定性良好，有效浓度下HEK-293、HaCaT细胞无明显损伤，体外生物相容性优良。
6. 木质素-银杂化纳米材料绿色低毒、抗菌高效，可作为新型医用创面抗菌敷料、食品接触抗菌材料开发原料。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 采用Bioscreen C蜂窝微孔高通量体系，同步设置空白、梯度AgLigNPs、梯度游离AgNPs多组平行，37℃恒温持续振荡，24 h每间隔固定时长自动采集OD600，全程密闭无需人工开盖移液，规避温度、污染、移液带来实验误差。
2. 区别单一终点分光读数，完整捕捉细菌延迟期、对数增殖、稳定期全过程，可精准区分轻微生长迟滞、完全抑菌两种状态，精确测定MIC临界浓度。
3. 一次性完成多浓度梯度、对照样品同步检测，大幅缩短抗菌初筛周期，微量肉汤体系节约银纳米珍贵样品。
4. 仪器输出标准化时序OD数据，可直接导入统计软件开展方差分析，消除肉眼判读主观偏差，银用量对比结论定量可靠。
5. Bioscreen浮游菌动态抑菌数据与材料表征、培养基稳定性、生物膜、细胞毒性多层次实验交叉印证，完整构建“木质素载体-银负载-低银释放-高效低毒抗菌”完整证据链。