全自动生长曲线分析仪

Characterization of the novel broad-spectrum lytic phage Phage_Pae01 and its antibiofilm efficacy against Pseudomonas aeruginosa

新型广谱裂解噬菌体Phage_Pae01的表征及其抗铜绿假单胞菌生物膜功效

来源：Frontiers in Microbiology, Volume 15, Article ID 1386830, 2024, 《微生物前沿》，第15卷，文章编号1386830，2024年，DOI:10.3389/fmicb.2024.1386830

摘要

多重耐药、碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌是临床难治条件致病菌，生物膜形成会大幅提升其抗生素耐受性，噬菌体是替代抗菌新策略。本研究从医院污水中分离得到新型裂解噬菌体Phage_Pae01，透射电镜显示其头部二十面体、长尾，属于肌尾噬菌体科；宿主谱测试可裂解83.6%临床铜绿菌株，包含多重耐药株。该噬菌体耐受4–60℃、pH4–10环境，最佳感染复数MOI为0.01，一步生长曲线潜伏期30 min，裂解量约10⁶/细胞；全基因组总长93182 bp，无毒力、耐药相关基因，安全性良好。实验采用BIOSCREEN C全自动浊度仪监测不同MOI下铜绿菌生长曲线，证实噬菌体可持续抑制浮游菌增殖；单独使用能抑制生物膜生成、清除成熟生物膜，与庆大霉素联用具备显著协同清除生物膜效果，扫描电镜验证联用后生物膜结构完全瓦解。本噬菌体宿主广、稳定性佳、无安全风险，可单独或联合抗生素用于铜绿生物膜相关感染防治。

关键词

铜绿假单胞菌；裂解噬菌体；Phage_Pae01；肌尾噬菌体；宿主谱；生物膜；庆大霉素；协同杀菌；Bioscreen C；全基因组测序

研究目的

1. 从医院污水分离纯化新型铜绿假单胞菌裂解噬菌体Phage_Pae01，完成形态、温度pH稳定性、一步生长曲线基础生物学表征。

2. 测定噬菌体对104株临床铜绿菌株裂解宿主范围，评估广谱应用潜力。

3. 利用Bioscreen C设备动态监测不同MOI下宿主菌生长，定量噬菌体体外裂解活性。

4. 解析噬菌体全基因组，筛查毒力、耐药基因，评估生物安全性。

5. 分别验证噬菌体单独、与庆大霉素联用抑制/清除生物膜的效果，阐明协同作用。

6. 为多重耐药铜绿生物膜感染提供噬菌体治疗备选材料。

研究思路

1. 噬菌体分离纯化：医院污水过滤富集，宿主菌Pa021共培养，双层琼脂平板反复纯化获得单噬菌斑。

2. 基础生物学鉴定：透射电镜观测形态分类；梯度温度、pH孵育测定活性留存；梯度MOI绘制一步生长曲线。

3. 宿主范围：104株临床铜绿菌株点斑实验统计裂解率。

4. 浮游菌裂解动力学：Bioscreen C微孔板设置多梯度MOI，每20 min读取OD600，连续监测细菌生长。

5. 基因组测序：DNA提取、Illumina测序，RAST注释，VFDB、CARD数据库比对毒力/耐药基因，构建系统发育树。

6. 生物膜实验：96孔板培养成熟生物膜，分别用噬菌体、庆大霉素、二者联合处理，结晶紫定量；12孔爬片培养样本扫描电镜观察生物膜微观结构。

研究亮点

1. 分离得到广谱肌尾噬菌体Phage_Pae01，可裂解超八成临床多重耐药铜绿菌株，克服噬菌体宿主狭窄短板。

2. 环境耐受范围宽，4–60℃、酸碱区间pH4–10维持高活性，适配临床、环境多场景使用。

3. 基因组无耐药、毒力基因，噬菌体治疗生物安全风险低。

4. 借助Bioscreen C长时动态生长监测，直观量化不同感染复数下持续抑菌能力。

5. 噬菌体与庆大霉素存在显著抗生物膜协同效应，联用可彻底破坏致密生物膜结构，弥补抗生素单独疗效不足。

可延伸的方向

1. 构建多噬菌体鸡尾酒制剂，进一步拓宽耐药菌株裂解谱。

2. 开展小鼠体内铜绿肺部/伤口感染模型，验证噬菌体体内治疗疗效。

3. 提取表达噬菌体裂解酶，单独评估裂解酶抑菌抗膜活性。

4. 探究噬菌体与其他类别抗生素的协同组合，筛选最优联用配比。

5. 开发噬菌体医用敷料、冲洗液，开展医疗器械表面生物膜防控测试。

6. 改造噬菌体尾丝蛋白，靶向提升特殊耐药菌株吸附裂解能力。

测量的数据及研究意义

1. 透射电镜噬菌体形态、噬菌斑外观图像，数据来源图1，研究意义：明确Phage_Pae01属于肌尾噬菌体科，噬菌斑透亮裂解能力强，完成分类学基础判定。

2. 温度、pH处理后噬菌体滴度统计，数据来源图3，研究意义：证实噬菌体环境稳定性优异，高温、酸碱临床使用场景下不易失活。

3. 一步生长曲线增殖动力学数据，数据来源图2A，研究意义：确定最优MOI=0.01，潜伏期短、单菌裂解产量高，具备高效扩增与杀菌基础。

4. Bioscreen C不同MOI细菌生长OD曲线，数据来源图2B，研究意义：直观呈现MOI越高细菌增殖抑制越显著，低剂量噬菌体也能长效压制宿主菌生长。

5. 104株临床菌株裂解宿主统计表，数据来源表1，研究意义：证明噬菌体广谱活性，对碳青霉烯、多重耐药铜绿均有裂解作用，适配院内耐药感染。

6. 噬菌体全基因组图谱、同源比对、系统发育树，数据来源图4、图5、图6，研究意义：基因组无毒力与耐药基因，同源噬菌体亲缘关系明确，证明使用安全性。

7. 结晶紫生物膜定量OD值，数据来源图7，研究意义：量化噬菌体单独抑制、清除生物膜效果，联用后清除能力大幅提升，存在协同作用。

8. 生物膜扫描电镜微观图像，数据来源图8，研究意义：直观观察对照组致密生物膜，药物组菌体稀疏、胞外基质瓦解，联用组生物膜几乎完全消失。

结论

1. 从医院污水分离得到新型肌尾裂解噬菌体Phage_Pae01，宿主覆盖率83.6%，可裂解多重耐药、碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌。

2. 该噬菌体热、酸碱耐受性强，最佳感染复数0.01，潜伏期30 min，单个宿主细胞裂解子代约10⁶个，体外持续抑制浮游菌增殖。

3. Phage_Pae01基因组全长93182 bp，不含毒力、抗生素耐药基因，用于抗感染治疗安全性高。

4. 噬菌体单独处理可抑制生物膜生成、清除成熟铜绿生物膜，效果优于单用庆大霉素；二者联用产生显著协同抗生物膜作用，可完全瓦解生物膜致密结构。

5. 该广谱稳定裂解噬菌体可单独使用，或与氨基糖苷类抗生素联合，作为多重耐药铜绿生物膜相关感染的新型防治候选制剂。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

1. 采用Bioscreen C高通量微孔检测体系，同步设置空白对照、多梯度MOI噬菌体组别，37℃恒温持续培养，每20 min自动检测OD600，全程密闭自动采集，无需人工反复开盖取样，规避温度、移液、交叉污染带来实验误差。

2. 区别单一终点平板计数，完整记录细菌迟滞、对数、稳定全周期生长动态，能够精准区分轻度迟滞、完全阻断增殖的浓度/感染复数差异，定量噬菌体长效抑菌能力。

3. 高通量一次性完成多梯度MOI平行样本检测，大幅缩短噬菌体裂解动力学筛选周期，微量肉汤体系节约噬菌体样品。

4. 仪器输出标准化时序OD数值，可直接导入统计软件做方差分析，消除肉眼判读平板主观偏差，生长抑制结论客观可重复。

5. Bioscreen浮游菌动态抑制数据与噬菌体形态、稳定性、基因组、生物膜电镜多层次实验交叉印证，完整构建“噬菌体理化特性—浮游菌裂解—生物膜清除”完整证据链。