全自动生长曲线分析仪

Application of novel nanomaterials with dual functions of antimicrobial and remineralization in mouthwashes

兼具抗菌与再矿化双重功能新型纳米材料在漱口水中的应用

来源：Scientific Reports, Volume 14, Article number 29027, 2024, 《科学报告》，第14卷，文章编号29027，2024年，DOI:10.1038/s41598-024-80703-9

摘要

龋齿是全球高发口腔疾病，常规漱口水仅单一抑菌或氟化物再矿化，存在黏膜刺激、氟安全隐患等缺陷。本研究以牡蛎壳碳酸钙为载体合成Ag/ZnO复合纳米材料，体外、体内系统评价其抑菌、牙釉质再矿化双重性能，并将其复配至无氟无醇漱口水。体外实验采用芬兰Bioscreen C全自动生长分析仪监测变形链球菌、嗜酸乳杆菌生物膜生长曲线，结果显示Ag/ZnO纳米复合材料可大量产生活性氧，破坏细菌细胞膜，对浮游菌与成熟生物膜均具备强效抑制作用；pH循环脱矿模型证明材料可释放钙、锌离子，逆转牙釉质矿物质流失，再矿化效果与氟化钠标准组接近。细胞实验证实该材料75、150 μg/mL浓度下人牙龈成纤维细胞毒性极低；SD大鼠口腔黏膜刺激实验表明含该纳米材料漱口水无黏膜红肿损伤，血清肝肾功能指标无异常。综上，Ag/ZnO牡蛎壳纳米复合材料兼具强效抗菌、牙釉质再矿化能力，生物安全性良好，可开发为新型防龋漱口水，具备临床应用价值。

关键词

Ag/ZnO纳米复合材料；牡蛎壳；漱口水；变形链球菌；嗜酸乳杆菌；生物膜；牙釉质再矿化；抗菌活性；口腔生物安全性；Bioscreen C

研究目的

1. 制备以牡蛎壳碳酸钙为载体的Ag/ZnO纳米复合功能材料，表征材料基础理化特性。

2. 借助Bioscreen C定量检测材料对变形链球菌、嗜酸乳杆菌浮游菌及成熟生物膜的生长抑制效果，阐明抗菌机制。

3. 构建牙釉质pH循环脱矿模型，评价材料促进牙釉质再矿化能力。

4. 开展人牙龈成纤维细胞体外毒性实验，评估材料细胞生物相容性。

5. 将纳米材料复配无氟无醇漱口水，体外验证漱口水抑菌、再矿功效。

6. 建立大鼠口腔黏膜接触体内模型，检测漱口水黏膜刺激性与肝肾系统毒性，综合评估体内安全性。

研究思路

1. 材料合成：牡蛎壳粉碎过筛，分步负载ZnO、银纳米颗粒，乙醇-水洗涤烘干制备Ag/ZnO/Oyster Shell复合材料，设置单一Ag、单一ZnO、纯牡蛎壳对照组。

2. 体外抗菌实验：琼脂抑菌圈定性；梯度浓度菌液培养，使用Bioscreen C连续48h测定OD600生长曲线，确定MIC、MBC；DCFH-DA荧光检测活性氧；扫描电镜观察细菌形态破坏；SYTO9/PI荧光染色观察生物膜活菌死菌比例。

3. 再矿化实验：制备离体牙釉质脱矿样本，建立pH循环模拟口腔酸碱环境，显微硬度计、表面轮廓仪、激光共聚焦扫描电镜检测牙釉质硬度、矿化缺损深度、矿物质流失量。

4. 细胞安全性：CCK8法检测不同材料浓度下人牙龈成纤维细胞增殖活力，显微镜观察细胞形态。

5. 漱口水配制：选用pH＞5.5无氟无醇商用漱口水为基质，添加300 μg/mL纳米材料，重复上述抑菌、再矿化全套体外检测。

6. 体内动物实验：SD大鼠每日两次口腔涂抹漱口水，连续14天；采集血液检测ALT、AST、BUN、CREA肝肾功能；颊舌黏膜HE染色病理评分，判断黏膜刺激性。

研究亮点

1. 天然牡蛎壳碳酸钙作为绿色载体，同步负载银、氧化锌纳米颗粒，实现抗菌、牙釉质再矿化双重一体化功能。

2. 采用Bioscreen C高通量长时程生物膜动态监测，精准量化纳米材料对成熟致龋生物膜持续抑制效果，区别静态终点检测。

3. 证实材料抗菌机制为诱导大量ROS生成，破坏细菌细胞膜结构，对浮游菌、致密生物膜均有强效清除能力。

4. 再矿化效果媲美氟化钠，同时无氟、无醇配方规避氟中毒、黏膜刺激风险。

5. 体外细胞、大鼠体内双重安全验证，黏膜无刺激、不损伤肝肾，适合长期日常口腔护理使用。

可延伸的方向

1. 优化纳米材料银锌配比，进一步提升抗菌同时降低制备成本。

2. 复配植物提取物，优化漱口水口感与长效抑菌留存能力。

3. 开展人体短期临床试验，检测人群使用后牙菌斑、牙釉质脱矿改善情况。

4. 探究纳米材料在义齿、正畸托槽涂层中的防生物膜应用潜力。

5. 长期动物毒性实验评估材料慢性全身蓄积风险。

6. 开发不同剂型（牙膏、口腔喷雾）系列防龋护理产品。

测量的数据及研究意义

1. Bioscreen C测得变形链球菌、嗜酸乳杆菌生物膜48h动态OD生长曲线，数据来源图2A、2B，研究意义：直观展示梯度浓度纳米材料对生物膜的浓度依赖性抑制，300 μg/mL可大幅削减活菌总量，为材料抗生物膜功效提供连续定量证据。

2. 琼脂抑菌圈、ROS荧光强度、细菌扫描电镜图像，数据来源图1，研究意义：证实Ag/ZnO复合体系协同抗菌，产生活性氧破坏细菌膜结构，解释双重金属纳米协同抑菌分子机制。

3. 牙釉质显微硬度、硬组织缺损深度、激光共聚焦矿化荧光数据，数据来源图4，研究意义：定量证明材料释放钙锌离子可显著修复脱矿牙釉质，再矿化效果与氟化钠阳性对照无显著差异。

4. CCK8细胞活力、细胞显微形态数据，数据来源图3，研究意义：75、150 μg/mL浓度细胞增殖率接近95%，证明低、中浓度材料无细胞毒性，生物相容性优良。

5. 含纳米漱口水抑菌、再矿化全套检测数据，数据来源图5，研究意义：验证纳米材料复配至无氟无醇漱口水后功能稳定，保留完整防龋双重活性。

6. 大鼠肝肾功能血清指标、黏膜组织病理切片评分，数据来源图6，研究意义：体内实验证明该漱口水无口腔黏膜刺激，不会造成肝肾损伤，长期使用安全性高。

结论

1. 以牡蛎壳为载体制备的Ag/ZnO纳米复合材料可产生活性氧破坏致龋菌细胞膜，对变形链球菌、嗜酸乳杆菌浮游菌与成熟生物膜均具备强效抑制作用。

2. 该材料可持续释放钙、锌离子，在模拟口腔酸碱循环环境中有效逆转牙釉质脱矿，再矿化效果与氟化钠相当。

3. 75、150 μg/mL浓度下人牙龈成纤维细胞无明显毒性，具备良好体外细胞生物安全性。

4. 复配该纳米材料的无氟无醇漱口水完整保留抗菌、再矿化双重功效，理化性质稳定。

5. 大鼠14天口腔涂抹体内实验证实，该漱口水不会造成颊舌黏膜损伤，血清肝肾指标无异常，体内使用安全。

6. Ag/ZnO牡蛎壳纳米复合材料是优良双功能口腔防龋原料，所配制漱口水具备广阔临床与日用口腔护理应用前景。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

1. 采用Bioscreen C蜂窝式96微孔板体系，同步设置空白对照、多梯度纳米材料浓度、两种致龋菌株，37℃恒温持续振荡，48小时每间隔固定时长自动读取OD600，全程密闭自动化检测，无需人工开盖分批取样。

2. 区别单一终点菌落计数，仪器完整记录生物膜延迟期、对数增殖、稳定衰亡全周期动态变化，可精准区分轻度抑制、完全清除的浓度阈值，定量结果更精细。

3. 高通量一次性完成数十组平行样本检测，大幅缩短生物膜抑菌筛选周期，微量菌液体系节约培养基与纳米样品耗材。

4. 全程恒温密闭培养，规避温度波动、开盖交叉污染、人工移液带来实验系统误差，生长曲线重复性、平行性更佳。

5. 仪器输出标准化连续时序OD数值，可直接导入统计软件做方差分析，消除肉眼判读菌斑主观偏差，为纳米材料抗生物膜活性提供客观时序定量支撑。

6. Bioscreen生物膜动力学数据与扫描电镜、ROS荧光、体外再矿化、体内安全性多层次实验交叉印证，完整构建“纳米材料-活性氧杀菌-牙釉质再矿化-体内安全”完整证据链。