全自动生长曲线分析仪

Disinfectant efficacy of glabridin against dried and biofilm cells of Listeria monocytogenes and the impact of residual organic matter

光甘草定对干燥、生物膜状态单增李斯特菌的消毒效果及残留有机质的影响

来源：Food Research International, Volume 191, Article ID 114613, 2024, 《国际食品研究》, 第191卷，文章编号114613，2024年，DOI:10.1016/j.foodres.2024.114613

摘要

光甘草定是甘草中提取的异戊二烯化异黄酮天然抗菌物质，现有研究证实其抑菌活性，但作为食品接触面消毒剂的应用研究十分匮乏。本研究先采用芬兰Bioscreen C微孔板稀释法测定8株不同血清型、分离来源的单增李斯特菌对光甘草定的MIC与MBC，所有菌株MIC为6.3–12.5 μg/mL、MBC均为25 μg/mL，菌株敏感性差异极小。参照欧盟消毒标准EN 13697:2019，以304不锈钢片为载体，分别构建干燥菌模型、20℃/10℃生物膜模型，采用酪蛋白、哈密瓜、烟熏三文鱼、脱脂牛奶模拟食品残留有机质，评价50、100、200 μg/mL光甘草定消毒能力。洁净表面（0.3 g/L BSA）200 μg/mL处理10 min可实现干燥菌＞4 log₁₀灭活；高有机质（3 g/L BSA）会大幅削弱消毒效果；不同食品基质干扰程度存在差异：哈密瓜残留影响微弱，三文鱼、脱脂牛奶会显著降低灭活能力。生物膜实验趋势与干燥菌一致，营养肉汤、哈密瓜体系200 μg/mL可实现＞3 log₁₀生物膜菌杀灭，乳制品、鱼肉基质中灭活不足1 log₁₀。机制推测光甘草定与食品中乳清蛋白、肌蛋白发生结合，降低游离有效药物浓度，低温（10℃）生物膜对光甘草定耐受度无明显上升。该研究证明光甘草定具备天然食品接触面消毒潜力，使用前需彻底清除高蛋白食品残留。

关键词

光甘草定；单增李斯特菌；食品接触面消毒；生物膜；干燥菌体；食品残留有机质；最小抑菌浓度；最小杀菌浓度；Bioscreen C；天然抗菌剂

研究目的

1. 借助Bioscreen C高通量微孔稀释法测定多株单增李斯特菌MIC、MBC，评估菌株间敏感性差异。

2. 依据欧盟标准EN 13697，建立不锈钢干燥菌体消毒模型，定量BSA蛋白残留对光甘草定灭活效果的影响。

3. 模拟哈密瓜、烟熏三文鱼、脱脂牛奶三类食品残留，对比不同食品基质对光甘草消毒活性干扰程度。

4. 构建常温、冷藏两种条件下单增李斯特菌生物膜，评价光甘草定清除生物膜能力及食品基质干扰效应。

5. 分析有机质削弱光甘草定活性的分子原因，为食品车间天然消毒剂使用规范提供依据。

6. 评估光甘草定在生鲜果蔬、水产、乳制品加工场景的适用范围。

研究思路

1. 菌株体外药敏测定：8株人源、食品源单增李斯特菌，采用Bioscreen C蜂窝微孔板30℃振荡培养24 h，连续监测OD600，计算MIC/MBC，筛选EGDe、L6、FBR17开展后续表面消毒实验。

2. 不锈钢载片标准化处理：按照欧盟标准完成清洗、异丙醇浸泡、高压灭菌，制备消毒载体。

3. 干燥菌体消毒实验：菌悬液分别混合不同浓度BSA、各类食品上清，滴于钢片37℃干燥，梯度光甘草定处理10 min，洗脱涂布计数log降低值。

4. 生物膜构建与消毒：20℃常温、10℃冷藏条件下，肉汤/食品基质孵育48 h/5 d形成生物膜，PBS洗去浮游菌后光甘草定处理，回收活菌定量。

5. 干扰物质对照设置：硬水空白、DMSO溶剂对照排除溶剂本身杀菌干扰，三组生物学重复做统计学分析。

6. 活性机制分析：结合已有文献，光甘草定可与白蛋白、乳球蛋白等蛋白结合，解释有机质削弱消毒活性的原因。

研究亮点

1. 首次采用欧盟标准体系系统评价光甘草定作为食品接触面消毒剂的潜力，同时覆盖干燥菌体、生物膜两类车间常见污染形态。

2. 利用Bioscreen C全自动生长分析仪批量测定多菌株药敏，证实单增李斯特菌不同菌株对光甘草定敏感性差异极低，应用稳定性高。

3. 区分三类食品基质干扰差异，哈密瓜低蛋白体系几乎不影响药效，水产、乳制品高蛋白残留会大幅降低灭活效果。

4. 证实10℃低温生物膜并未显著提升光甘草定耐受性，低温加工场景仍可使用该天然消毒剂。

5. 明确蛋白结合是药效下降核心机制，提出“先去除高蛋白食品残渣再消毒”的车间操作方案。

可延伸的方向

1. 开发光甘草定复配助剂，阻断与食品蛋白结合，抵消有机质干扰。

2. 开展光甘草定长期接触不锈钢的材料腐蚀、感官残留安全性测试。

3. 动物细胞毒理实验，评估光甘草定食品接触安全性。

4. 扩大食源致病菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）测试，拓宽消毒剂适用范围。

5. 探究光甘草定复合有机酸协同消毒效果，降低使用浓度。

6. 车间中试试验，验证实际生产线消毒应用效果。

测量的数据及研究意义

1. Bioscreen C测定8株李斯特菌MIC、MBC数值，数据来源表1，研究意义：量化所有受试菌株MIC集中6.3–12.5 μg/mL、MBC统一25 μg/mL，菌株敏感性变异极小，说明光甘草定广谱稳定抑制各类单增李斯特菌。

2. 不同BSA浓度下干燥菌log灭活值，数据来源图1，研究意义：0.3 g/L洁净蛋白环境200 μg/mL可达到4 log₁₀达标杀菌，3 g/L高污染蛋白几乎无灭活效果，证明表面清洁程度直接决定消毒成败。

3. 哈密瓜/三文鱼/脱脂牛奶基质干燥菌杀灭对数，数据来源图2，研究意义：明确果蔬低残留干扰微弱，水产、乳制品高蛋白残留显著降低药效，为分品类车间消毒方案提供数据支撑。

4. 20℃不同食品基质生物膜灭活数据，数据来源图3，研究意义：肉汤、哈密瓜体系200 μg/mL可实现＞3 log₁₀生物膜清除，乳制品、鱼肉基质灭活不足1个对数，生物膜与干燥菌受基质干扰规律一致。

5. 10℃冷藏生物膜杀灭结果，数据来源图4，研究意义：低温形成生物膜对光甘草定耐受度无明显上升，冷藏加工环境可正常使用该消毒剂。

6. 各对照组活菌计数、培养基pH检测，研究意义：排除DMSO溶剂、pH变化对杀菌结果的干扰，保证消毒效果差异仅由食品有机质、光甘草定浓度造成。

结论

1. 芬兰Bioscreen C微孔稀释实验证明8株不同血清、来源单增李斯特菌对光甘草定敏感性差异极小，统一MIC 6.3–12.5 μg/mL，MBC 25 μg/mL。

2. 200 μg/mL光甘草定在低蛋白洁净不锈钢表面处理10 min，可将干燥单增李斯特菌降低4个对数以上，满足欧盟消毒剂标准；高浓度BSA蛋白残留会大幅削弱杀菌活性。

3. 食品基质干扰存在明显差异：哈密瓜果蔬残留对消毒效果影响微弱，烟熏三文鱼、脱脂牛奶中大量蛋白会与光甘草定结合，显著降低灭活能力。

4. 常温20℃、冷藏10℃条件下形成的单增李斯特生物膜均可被200 μg/mL光甘草定有效清除（肉汤/哈密瓜体系＞3 log₁₀），低温不会增强细菌药物耐受性。

5. 光甘草定作用靶点为细菌细胞膜，食品中乳清蛋白、肌蛋白与药物结合是消毒活性下降核心原因，食品车间使用前需彻底清洗高蛋白残渣。

6. 光甘草定是极具潜力的天然食品接触面消毒剂，适合果蔬加工环境，水产、乳制品车间需强化前置清洁步骤。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

1. 采用Bioscreen C专用蜂窝96孔微孔板，一次性同步设置8株李斯特菌、多梯度光甘草定浓度，30℃持续振荡24 h，每固定间隔自动读取OD600，全程密闭自动化检测，无需人工分次移液、开盖，规避温度波动、交叉污染、操作误差。

2. 依靠连续动态生长曲线而非单一终点吸光度，精准区分完全抑制、部分生长、正常增殖，精确计算MIC与MBC，相比人工平板稀释法重复性更高、误差更小。

3. 高通量批量检测大幅缩短多菌株药敏筛选周期，微量肉汤体系节约光甘草定珍贵天然样品，适合天然抗菌物质大规模构效初筛。

4. 仪器输出标准化时序OD数值，可直接导入统计软件开展多菌株方差分析，客观量化菌株间敏感性差异，得出“菌株变异低”可靠定量结论。

5. Bioscreen获得的药敏基础数据与不锈钢干燥菌、生物膜表面消毒多层次实验交叉印证，完整建立“体外抑菌能力—食品表面实际消毒效果—有机质干扰”完整证据链。

6. 该标准化微孔稀释流程完全匹配欧盟消毒标准前置药敏测试要求，可作为食品天然消毒剂体外活性通用标准化检测手段。