全自动生长曲线分析仪

Optimization of the Conditions for the Transformation of a Bacillus subtilis Strain L11 to Prepare Nano Selenium and Its Preliminary Application in Sheep Feed

枯草芽孢杆菌L11转化制备纳米硒的条件优化及其在绵羊饲料中的初步应用

来源：Microbiol. Res., Volume 15, Pages 326-341，2024, 《微生物研究》，第15卷，页码326-341，2024年，DOI:10.3390/microbiolres15010022

摘要

纳米硒相比无机硒生物利用率更高、毒性更低，在医药、畜牧营养、抑菌领域应用前景广阔。本研究从湖北富硒奶牛养殖场牧草样品中筛选获得枯草芽孢杆菌L11，结合形态、生理生化与16S rDNA测序完成菌种鉴定；采用芬兰Bioscreen CMBR微生物生长分析仪监测菌株生长，通过单因素与响应面法优化亚硒酸钠生物转化制备纳米硒（SeNPs）工艺，确定最优条件：pH6、37℃、4 mmol/L亚硒酸钠、培养48 h。利用SEM-EDS、TEM、XPS表征证实产物为50–200 nm单质纳米硒；细胞组分分离实验证明菌株主要在周质空间、细胞膜、细胞壁完成亚硒酸钠还原生成纳米硒。动物饲喂实验显示，将L11-纳米硒复合菌剂添加至绵羊日粮，可显著提升绵羊血清IgG、SOD、T-AOC、GSH-Px抗氧化与免疫指标，降低氧化损伤产物MDA，同时提高颈肌、肝脏、脾脏硒蓄积量，该菌株可作为富硒益生菌饲料添加剂开发。

关键词

枯草芽孢杆菌L11；纳米硒；生物合成；亚硒酸钠；响应面优化；细胞亚定位；抗氧化；绵羊免疫；Bioscreen CMBR；饲料添加剂

研究目的

1. 从富硒养殖环境筛选可高效还原亚硒酸钠的芽孢杆菌，通过分子生物学手段鉴定菌株分类地位。

2. 借助芬兰Bioscreen CMBR设备测定不同培养基、温度、pH、转速下菌株生长曲线，明确菌株基础生长最优条件。

3. 采用单因素结合Box-Behnken响应面设计，优化枯草芽孢杆菌L11转化制备纳米硒的工艺参数。

4. 利用多种表征技术分析纳米硒粒径、形貌、元素价态，明确菌株合成纳米硒的细胞亚定位。

5. 开展绵羊饲喂试验，评价L11纳米硒菌剂对机体抗氧化、免疫水平与组织硒沉积的影响。

6. 为生物源纳米硒益生菌饲料添加剂提供标准化制备工艺与畜牧应用实验依据。

研究思路

1. 菌株分离鉴定：富硒牧草样品经高浓度亚硒酸钠胁迫筛选，平板分离纯化；菌落显微观察、生化鉴定、16S rDNA扩增测序构建进化树，确定为枯草芽孢杆菌L11。

2. 菌株生长条件筛选：LB、枯草杆菌通用两种培养基，设置梯度温度、pH、摇速，Bioscreen CMBR每小时检测OD600，绘制生长曲线对比生长性能。

3. 纳米硒转化条件优化：梯度亚硒酸钠浓度筛选耐受区间；单因素考察温度、pH、转速对硒还原率影响；三因素三水平响应面拟合回归模型，得到最优合成参数。

4. 纳米硒表征与亚定位：分离菌体胞外、周质、胞质、膜壁蛋白组分显色判定硒生成位置；SEM-EDS观测颗粒分布元素；TEM观测粒径；XPS解析硒元素价态。

5. 绵羊饲喂试验：对照组基础日粮，试验组添加L1纳米硒菌剂，饲喂40 d；采血检测免疫、抗氧化指标，解剖测定颈肌、肝、肺、脾脏硒含量。

6. 数据统计：SPSS、Origin完成方差、邓肯多重比较与绘图分析。

研究亮点

1. 筛选得到新型枯草芽孢杆菌L11，可温和生物还原亚硒酸钠生成低毒单质纳米硒，全程无化学有毒试剂。

2. 利用Bioscreen CMB高通量设备批量监测多培养条件下菌株生长，快速锁定基础培养最优参数，缩短条件筛选周期。

3. 明确纳米硒合成发生于菌体周质空间、细胞膜、细胞壁，阐明芽孢杆菌亚硒酸钠还原的细胞区域机制。

4. 响应面模型精准拟合温度、pH、转速交互作用，得到高效纳米硒标准化制备工艺，还原率达72%以上。

5. 体内绵羊实验证实菌剂可同步提升动物免疫、抗氧化能力并富集组织硒，兼具富硒与益生双重功能。

可延伸的方向

1. 优化发酵罐放大工艺，实现L11纳米硒菌剂工业化批量生产。

2. 探究该菌株对水产、家禽等畜禽品种的饲喂效果，拓宽应用畜禽品类。

3. 开展L11纳米硒复合抑菌实验，评价其畜牧环境致病菌抑制活性。

4. 转录组测序解析菌株还原亚硒酸钠的关键代谢通路与功能基因。

5. 复配复合益生菌，构建多菌种富硒饲料复合添加剂。

6. 开展长期动物毒理实验，明确菌剂长期饲喂安全剂量范围。

测量的数据及研究意义

1. Bioscreen CMBR测定不同培养基、温度、pH、转速下L11菌株OD生长曲线，数据来源图2，研究意义： 直观量化各培养条件下菌株增殖差异，确定LB培养基、37℃、pH6、200 rpm为最优基础生长条件，为后续硒转化实验提供菌体培养标准。

2. 单因素硒还原率、响应面三维曲面数据，数据来源图3，研究意义：量化温度、pH、转速交互影响，得到最优转化参数：pH6、37℃、150 rpm、4 mmol/L亚硒酸钠、48 h培养，硒还原率最高73.5%。

3. 菌体各细胞组分显色图像，数据来源图4，研究意义：直观证明亚硒酸钠还原生成纳米硒主要发生在周质空间、细胞膜、细胞壁区域，明确合成细胞位点。

4. SEM-EDS、TEM、XPS表征图谱，数据来源图5、图6、图7、表1，研究意义：证实产物为50–200 nm球形单质硒纳米颗粒，无杂质重金属，生物安全性高。

5. 绵羊血清免疫、抗氧化指标统计数据，数据来源表2，研究意义：菌剂饲喂可极显著提升IgG、SOD、T-AOC、GSH-Px，降低MDA，证明可改善绵羊免疫与抗氧化应激能力。

6. 绵羊各组织硒含量检测数据，数据来源表3，研究意义：颈肌、肝脏、脾脏硒含量显著上升，肺组织无明显变化，说明该菌剂可定向提升畜禽可食用组织硒沉积。

结论

1. 从富硒牧场分离鉴定枯草芽孢杆菌L11，耐受亚硒酸钠并可将其还原为单质纳米硒颗粒。

2. 经Bioscreen CMB生长监测与响应面优化，该菌株最优纳米硒合成条件为pH6、37℃、摇速150 rpm、4 mmol/L亚硒酸钠培养48 h，硒还原率最高73.5%。

3. L11主要依靠周质空间、细胞膜、细胞壁完成亚硒酸钠还原，合成50–200 nm球形单质纳米硒，无有毒高价硒残留。

4. 日粮添加L11-纳米硒复合菌剂能显著提高绵羊机体免疫球蛋白与抗氧化酶活力，减轻氧化损伤。

5. 该菌剂可显著提升绵羊颈肌、肝脏、脾脏硒蓄积量，适合作为畜牧富硒益生菌饲料添加剂开发。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

1. 采用芬兰Bioscreen CMBR全自动浊度分析仪配套蜂窝微孔板，一次性同步设置多种培养基、温度、pH、转速平行组别，37恒温持续振荡，每小时自动采集OD600，24 h不间断记录完整生长周期，全程密闭自动化检测，无需人工多次取样测浊，规避温度、移液、污染带来实验误差。

2. 区别单时点分光光度法，完整捕获迟滞、对数、稳定全生长阶段细微差异，精准对比不同培养条件下菌株生长快慢，快速筛选最优基础培养体系。

3. 高通量并行检测大幅缩减多梯度培养条件筛选实验时长，微量培养液节约培养基原料，适合微生物发酵条件初筛。

4. 仪器输出连续时序OD数值，可直接导入统计软件完成方差分析，消除肉眼判读平板主观偏差，生长数据定量可重复。

5. Bioscreen生长动力学结果与纳米硒合成优化、细胞定位、动物饲喂多层次实验交叉印证，完整构建“培养条件—菌株生长—硒转化效率—畜牧应用”完整证据链。