Multimodal vaccination targeting the receptor binding domains of Clostridioides difficile toxins A and B with an attenuated Salmonella Typhimurium vector (YS1646) protects mice from lethal challenge
利用减毒鼠伤寒沙门氏菌载体YS1646靶向艰难梭菌毒素A、B受体结合域的多模式疫苗可保护小鼠免受致死攻毒
来源：Microbiology Spectrum, Volume 12, Issue 2, February 2024,《微生物学谱》，第12卷第2期，2024年2月，DOI:10.1128/spectrum.03109-22
摘要
传统肌肉注射艰难梭菌类毒素三期临床疫苗仅诱导全身IgG应答，无法有效防控感染复发，临床终点未达标。本研究改造减毒鼠伤寒沙门氏菌YS1646作为口服递送载体，将艰难梭菌毒素A、B受体结合域rbdA/rbdB通过Tn7转座子稳定整合至细菌染色体，构建无抗性安全疫苗菌株。设计多模式免疫方案：第0天肌肉注射重组rbd抗原，第0、2、4天口服工程沙门氏菌；单纯口服、肌注+口服联合两种方案开展小鼠免疫。结果显示联合免疫组血清IgG滴度、抗体亲和力显著高于单纯肌注组；口服疫苗偏向诱导Th1型IgG2c，肌注仅产生Th2型IgG1；肠系膜淋巴结IL-5分泌与IgA浆细胞数量上调，肠道黏膜特异性IgA显著升高。低剂量攻毒模型中，仅肌注保护效果有限，高剂量单一rbdA多模式免疫、双抗原联合免疫可实现小鼠100%存活。菌株生长曲线采用Bioscreen C测定，证实整合外源抗原后菌株生长仅轻微受损，遗传稳定。研究证明肌注联合口服多模式策略可同步诱导全身与肠道黏膜双重保护性免疫，YS1646载体疫苗是艰难梭菌感染新型预防候选方案。
关键词
艰难梭菌；减毒沙门氏菌YS1646；毒素受体结合域；多模式疫苗；黏膜免疫；全身抗体；IgA；IgG亚型；Tn7染色体整合；动物攻毒模型
研究目的
1. 构建染色体稳定整合rbdA、rbdB的减毒沙门氏菌YS1646疫苗株，消除质粒与抗性基因带来的临床应用安全隐患。
2. 对比单纯肌肉注射、单纯口服、肌注+口服多模式三种免疫方案诱导的全身、肠道黏膜抗体水平与Ig亚型差异。
3. 采用Bioscreen测定工程菌生长，评估外源抗原插入对菌株生长适应性的影响。
4. 检测肠系膜淋巴结细胞因子分泌、IgA浆细胞数量，解析疫苗诱导黏膜免疫的细胞机制。
5. 不同剂量艰难梭菌致死攻毒，量化各免疫组小鼠生存率与发病严重程度，评价疫苗保护效力。
6. 验证双抗原联合疫苗优势，为临床口服+注射复合疫苗开发提供实验依据。
研究思路
1. 载体菌株改造：Tn7自杀质粒携带frr/pagC启动子、SspH分泌信号与rbd片段，接合导入YS1646，Flp重组去除氯霉素抗性盒，PCR与测序验证整合，Western blot检测抗原表达。
2. 生长动力学检测：芬兰Bioscreen C仪器连续24h监测野生与重组沙门氏菌OD600生长曲线，评估菌株适应性。
3. 重组蛋白制备：大肠杆菌表达纯化rrbdA/rrbdB，作为肌注免疫抗原。
4. 小鼠分组免疫：分为PBS空白、单纯肌注抗原、单纯口服YS1646、肌注+口服多模式四组，免疫5周后采样检测免疫指标。
5. 免疫指标检测：ELISA检测血清总IgG、IgG1/IgG2c亲和力、小肠黏膜IgA；ELISpot计数肠系膜淋巴结IgA分泌浆细胞；多因子试剂盒测定mLN细胞IL-5等细胞因子。
6. 艰难梭菌攻毒实验：抗生素预处理小鼠肠道菌群，低/高剂量活菌灌胃攻毒，每日记录症状评分与生存期，统计保护率。
7. 多组统计学分析，对比不同免疫策略的免疫应答与保护效果差异。
研究亮点
1. 首次构建Tn7染色体定点整合、无抗性标记的YS1646工程菌，解决质粒型疫苗不稳定、携带耐药基因的临床安全缺陷。
2. 证实多模式（肌注+口服）疫苗同时诱导Th1/Th2混合型免疫，兼顾全身中和IgG与肠道黏膜IgA，弥补传统肌注疫苗无黏膜应答短板。
3. 借助Bioscreen高通量生长定量，证明染色体插入仅轻微降低菌株生长速率，工程菌体内定植与递送能力不受明显影响。
4. 高剂量rbdA多模式免疫、rbdA+rbdB联合免疫均可实现小鼠100%抵御致死艰难梭菌攻毒，保护效果优于单一口服或单纯肌注。
5. 阐明口服沙门氏菌可刺激肠系膜淋巴结IL-5分泌，促进IgA+浆细胞增殖，建立肠道黏膜防御屏障。
可延伸的方向
1. 开展非人灵长类动物实验，验证YS1646口服疫苗人体适用性与免疫持久性。
2. 优化启动子与分泌信号序列，提升沙门氏菌胞内rbd抗原表达量。
3. 开发冻干口服制剂，简化临床给药流程，提升疫苗储存稳定性。
4. 探究疫苗联合万古霉素等抗生素，降低艰难梭菌复发感染概率。
5. 检测疫苗诱导记忆T细胞应答，评估长期保护时效。
6. 改造载体共表达多种艰难梭菌毒力抗原，开发广谱多价口服疫苗。
测量的数据及研究意义
1. Bioscreen连续24h菌株生长OD曲线，数据来源：图1D，研究意义：量化对比野生YS1646与rbd整合株生长速率，外源基因插入仅轻微降低菌株适应性，证明工程菌具备体内定植递送能力，适合口服免疫。
2. Western blot抗原表达电泳条带，数据来源：图1C，研究意义：筛选frr_SspH1_rbdA、pagC_SspH1_rbdB两株稳定表达抗原菌株，为后续动物实验提供合格疫苗载体。
3. 血清IgG滴度、IgG亲和力、IgG1/IgG2c比值ELISA数据，数据来源：图2，研究意义：单纯肌注偏向Th2型IgG1，口服诱导Th1型IgG2c，多模式免疫同时提升抗体总量与结合亲和力，中和毒素能力更强。
4. 肠系膜淋巴结IL-5细胞因子浓度、IgA浆细胞ELISpot计数，数据来源：图3A、3B，研究意义：肌注联合口服组IL-5与IgA分泌细胞显著升高，明确口服沙门氏菌靶向肠道相关淋巴组织、激活黏膜免疫的机制。
5. 小肠黏膜抗原特异性IgA定量，数据来源：图3C，研究意义：仅含口服疫苗组别可产生肠道IgA，直接解释多模式疫苗能阻断肠道局部毒素损伤的优势。
6. 小鼠攻毒生存曲线、临床症状评分，数据来源：图4，研究意义：低剂量攻毒单纯肌注仅部分保护，高剂量单一rbdA多模式、双抗原联合免疫实现100%小鼠存活，证实复合免疫策略的临床应用价值。
结论
1. 通过Tn7定点整合与Flp抗性去除，成功构建无耐药标记、稳定表达艰难梭菌rbdA/rbdB的减毒YS1646沙门氏菌疫苗株，Bioscreen生长实验证明菌株适应性仅轻微下降。
2. 单纯肌肉注射重组抗原仅诱导Th2型血清IgG，无肠道黏膜IgA；单纯口服可产生黏膜IgA但血清抗体水平偏低；肌注+口服多模式方案可同步诱导全身高亲和力IgG与肠道保护性IgA，平衡Th1/Th2应答。
3. 口服YS1646疫苗可刺激肠系膜淋巴结分泌IL-5，促进IgA阳性浆细胞增殖，构建肠道局部免疫屏障。
4. 低剂量艰难梭菌攻毒模型中单纯肌注保护有限；高剂量rbdA多模式免疫、rbdA+rbdB联合免疫均可完全保护小鼠抵御致死感染，发病症状显著减轻。
5. 基于YS1646的多模式疫苗弥补传统肌注类毒素疫苗缺乏黏膜免疫的缺陷，具备进入I期临床试验的开发潜力。
6. 染色体定点整合型沙门氏菌载体安全性优于质粒载体，可作为多种肠道致病菌口服疫苗通用递送系统。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 采用Bioscreen C 100孔蜂窝高通量微孔板，同步设置野生YS1646、rbdA、rbdB整合菌株四生物学重复，37℃每30min自动读取OD600，连续监测24h完整生长周期。
2. 全程密闭恒温振荡自动化检测，无需人工多次开盖取样，消除温度、移液、交叉污染带来系统误差，各组生长曲线平行可比。
3. 核心对照价值：直观定量外源抗原染色体插入仅小幅降低菌株生长速率，证明改造后沙门氏菌仍可在肠道有效定植、递送抗原，不会因生长缺陷丧失免疫激活能力。
4. 微量LB培养体系大幅节约培养基，无需多批次平板菌落计数，快速批量筛选稳定抗原表达菌株，缩短载体构建验证周期。
5. 仪器输出标准化连续时序OD数值，可直接导入统计软件计算平均生长速率，无肉眼判读主观偏差，为疫苗株体内定植可行性提供定量体外证据。
6. Bioscreen生长动力学数据与蛋白表达、小鼠免疫攻毒多层次实验交叉印证，建立“载体改造—生长适应性—黏膜免疫—感染保护”完整证据链。