全自动生长曲线分析仪

Synbiotics containing sea buckthorn polysaccharides ameliorate DSS-induced colitis via regulating Th17/Treg homeostasis through intestinal microbiota and their production of BA metabolites and SCFAs

含沙棘多糖的合生制剂通过调控肠道菌群及其胆汁酸、短链脂肪酸代谢产物维持Th17/Treg稳态缓解小鼠DSS诱导结肠炎

来源：International Journal of Biological Macromolecules, Volume 276, Article ID 133794, 2024,

《国际生物大分子杂志》，第276卷，文章编号133794，2024年, DOI:10.1016/j.ijbiomac.2024.133794

摘要

炎症性肠病（IBD）全球发病率持续升高，传统激素类、氨基水杨酸类药物副作用大，合生制剂是安全干预手段。本研究以长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌搭配沙棘多糖制备合生制剂（SYN），构建DSS诱导小鼠急性结肠炎模型，单独益生菌（PRO）、单独沙棘多糖（PRE）作为对照开展干预。结果显示SYN可显著降低小鼠疾病活动指数DAI，缓解体重下降，恢复结肠长度，修复肠道黏膜屏障。分子检测表明SYN下调IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17F等促炎因子与Th17转录因子RORγt，上调抑炎因子IL-10、Treg转录因子Foxp3；16S rDNA测序显示SYN富集乳杆菌属、乳球菌属、拟杆菌、阿克曼菌等调控Th17/Treg平衡的关键肠道菌；菌群代谢产物短链脂肪酸SCFA、各类胆汁酸BA含量显著提升。机制层面，合生制剂重塑肠道菌群结构，提升SCFA与胆汁酸合成，抑制IκB/NF-κB炎症信号通路，平衡Th17/Treg免疫稳态，最终减轻肠道炎症损伤，相比单独益生菌、单独多糖干预效果更优。

关键词

沙棘多糖；合生制剂；DSS结肠炎；肠道菌群；Th17/Treg平衡；短链脂肪酸；胆汁酸；肠道屏障；NF-κB通路；小鼠炎症模型

研究目的

1. 探究沙棘多糖+长双歧杆菌+嗜酸乳杆菌合生制剂对DSS诱导小鼠结肠炎的预防干预效果，对比单独益生菌、单独多糖作用差异。

2. 利用Bioscreen仪器筛选两株益生菌最优混合培养比例，同时确定沙棘多糖作为益生元适宜添加浓度。

3. 阐明合生制剂对小鼠肠道黏膜屏障紧密连接蛋白、黏蛋白表达的修复作用。

4. 解析SYN调控肠道菌群群落结构、菌群SCFA与胆汁酸代谢产物的变化规律。

5. 揭示合生制剂通过菌群代谢物调控Th17/Treg免疫平衡、抑制NF-κB炎症通路分子机制。

6. 建立肠道菌群、代谢产物、肠道免疫三者关联，为炎症性肠病天然膳食干预提供理论依据。

研究思路

1. 菌株配比与益生元优化：采用芬兰Bioscreen C微生物生长自动分析仪，设置长双歧杆菌:嗜酸乳杆菌1:2~2:1梯度比例，添加0.5%~3.0%梯度沙棘多糖厌氧培养，每小时测OD600，42h连续记录生长曲线，筛选最优复配比例与多糖浓度。

2. 动物分组造模：60只C57BL/6小鼠分为空白、DSS模型、单独益生菌、单独沙棘多糖、合生制剂5组，连续60天灌胃干预后3%DSS饮水诱导急性结肠炎，记录体重、进食、DAI评分。

3. 肠道屏障评价：测量结肠长度；H&E、阿尔辛蓝染色观察黏膜与杯状细胞；RT-q检测ZO-1、Claudin-1、MUC2紧密连接与黏蛋白基因。

4. 肠道菌群分析：小鼠粪便提取DNA，16S rDNA V3-V4区高通量测序，分析α/β多样性、门/科/属水平菌群丰度变化。

5. 代谢物定量：GC检测粪便短链脂肪酸，LC-MS/MS测定结肠内容物各类初级、次级胆汁酸含量，同步检测SCFA/BA受体GPR41、GPR43、VDR、FXR表达。

6. 免疫与通路检测：RT-qPCR检测Th17、Treg相关细胞因子与转录因子；Western blot测定p-NF-κB、p-IκB蛋白表达；菌群、代谢、炎症指标开展皮尔相关性分析。

研究亮点

1. 借助Bioscreen高通量生长体系一次性完成益生菌配比、沙棘多糖浓度梯度筛选，确定7:8菌株配比、2%沙棘多糖为最优合生配方。

2. 证实合生制剂协同作用优于单一益生菌或单一多糖，可同时修复肠道屏障、重塑紊乱肠道菌群。

3. 完整阐明代谢物介导免疫调控通路：SCFA、胆汁酸上调对应受体，抑制NF-κB通路，维持Th17/Treg稳态。

4. 筛选出乳杆菌、阿克曼菌、拟杆菌等关键有益菌，其丰度与抑炎因子、结肠长度显著正相关，与促炎因子负相关。

5. 构建菌群-代谢物-Th17/Treg-NF-κB完整调控轴，为天然功能性食品干预肠炎提供分子证据。

可延伸的方向

1. 开展人体临床试验，验证该合生制剂对溃疡性结肠炎轻症人群肠道菌群与炎症指标改善效果。

2. 改造益生菌强化SCFA、胆汁酸合成能力，搭配沙棘多糖开发高活性复合益生元制剂。

3. 探究不同剂量沙棘多糖、不同益生菌组合的协同抗炎差异，优化产品配方。

4. 利用多组学（宏基因组、代谢组）深度解析合生制剂调控宿主肠道全局代谢网络。

5. 探究合生制剂对肠脑轴、全身慢性低度炎症的延伸调控作用。

6. 开发肠溶微胶囊型合生制剂，提升胃酸耐受度，延长肠道定植时间。

测量的数据及研究意义

1. Bioscreen C连续42h菌株生长OD曲线、发酵pH数据，研究意义：定量不同菌株配比、沙棘多糖浓度下菌株增殖能力，确定7:8混合比例、2%多糖可实现菌株最优生长，为合生制剂制备提供标准化配比参数。

2. 小鼠体重、进食量、DAI评分、结肠长度统计，数据来源图1，研究意义：直观证明DSS模型小鼠肠道损伤严重，合生制剂干预可显著缓解消瘦、便血、结肠萎缩，干预效果优于单一原料。

3. 结肠组织染色切片、紧密连接与黏蛋白基因mRNA定量，数据来源图2，研究意义：证实合生制剂上调ZO-1、Claudin-1、MUC2表达，修复黏膜黏液层与上皮屏障，降低肠道通透性。

4. 16S测序菌群α/β多样性、各分类水平菌群丰度，数据来源图3，研究意义：明确DSS造成菌群多样性下降、有害菌富集，SYN显著提升乳杆菌、阿克曼菌等有益菌丰度，重塑稳态菌群结构。

5. GC短链脂肪酸、LC-MS/MS胆汁酸定量，及其受体基因表达数据，数据来源图4，研究意义：量化合生制剂大幅提升乙酸、丙酸、丁酸与多种胆汁酸含量，上调GPR41/GPR43/FXR/VDR受体，是免疫调控关键中间介质。

6. Th17/Treg细胞因子、转录因子RT-q数据，数据来源图5，研究意义：阐明SYN抑制RORγt与IL-17家族促炎因子，提升Foxp3、IL-10、TGF-β，恢复Th17/Treg免疫平衡。

7. NF-κB通路蛋白Western灰度定量，数据来源图6，研究意义：证明合生制剂抑制IκB磷酸化降解，减少活化型p-NF-κB，阻断下游炎症级联反应。

8. 菌群、代谢、炎症指标相关性热图，数据来源图7，研究意义：建立有益菌-高SCFA/胆汁酸-抑炎表型正相关规律，完整解释合生制剂抗炎分子逻辑。

结论

1. 经Bioscreen仪器筛选得到长双歧杆菌:嗜酸乳杆菌=7:8、2%沙棘多糖的最优合生配方，该合生制剂可有效预防DSS诱导小鼠急性结肠炎。

2. SYN干预可缓解小鼠体重降低、便血等临床症状，恢复结肠长度，上调紧密连接与黏蛋白基因，修复受损肠道黏膜屏障。

3. 合生制剂显著纠正DSS造成的肠道菌群失调，提升乳杆菌、阿克曼菌、拟杆菌等有益菌丰度，提高短链脂肪酸、初级/次级胆汁酸代谢水平。

4. 菌群代谢产物激活肠道SCFA、胆汁酸受体，抑制IκB/NF-κB炎症信号通路，下调Th17相关促炎因子，上调Treg抑炎因子，恢复肠道Th17/Treg免疫稳态。

5. 单一益生菌、单一沙棘多糖仅具备有限抗炎效果，合生制剂二者协同作用，对肠道菌群、屏障、免疫的综合调控能力更强。

6. 菌群、代谢产物、肠道免疫存在显著关联，基于沙棘多糖的合生制剂可作为炎症性肠病安全膳食辅助干预方案。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

1. 采用Bioscreen C全自动微生物生长分析仪96孔蜂窝板体系，同步设置多菌株配比、4个多糖浓度梯度多组平行，37℃厌氧持续振荡，每小时自动读取OD600，连续监测42h完整增殖曲线，无需人工分次取样，规避厌氧开盖污染、温度波动、移液操作带来系统误差。

2. 一次性完成益生元适配菌株高通量筛选，替代传统平板计数分批实验，大幅缩短配方优化实验周期，批量对比各组菌株增殖峰值与生长速率。

3. 标准化连续时序OD数据可直接做统计学方差分析，客观量化不同配比、多糖浓度对益生菌促增殖效果，无肉眼判读主观偏差，精准筛选最优合生组合。

4. 微量液体培养体系大幅节约MRS培养基、沙棘多糖珍贵样品，降低配方筛选耗材与人力成本。

5. 同步配套发酵pH自动检测，结合生长曲线双重指标评价益生元活性，综合判定沙棘多糖促益生菌定植潜力。

6. Bioscreen获得的菌株生长最优配比数据是后续动物体内合生制剂给药配方的核心体外依据，与动物炎症、菌群、免疫多层次结果交叉印证，形成体外筛选-体内功效完整证据链。