Camouflaging attenuated Salmonella by cryo-shocked macrophages for tumor-targeted therapy
液氮冷冻冲击巨噬细胞伪装减毒沙门氏菌用于肿瘤靶向治疗
来源：Signal Transduction and Targeted Therapy, Volume 9, Article ID 14, 2024,《信号转导与靶向治疗》，第9卷，文章编号14,2024年，DOI:10.1038/s41392-023-01703-1
摘要
活菌肿瘤免疫治疗存在体内易被中性粒细胞清除、全身炎症毒副作用强的痛点，制约临床转化。本研究利用液氮冷冻冲击处理载减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的RAW264.7巨噬细胞，制备“死细胞但保留功能”的冷冻冲击巨噬细胞（LNT MACS/VNP）。液氮处理后巨噬细胞丧失体内致瘤能力、细胞结构完整，胞内沙门氏菌活性不受损伤，进入机体后延迟释放、定植肿瘤。该特洛伊木马递送体系可隔绝沙门氏菌抗原暴露，避免外周中性粒细胞激活与清除，大幅提升肿瘤内细菌富集量；体内实验证实制剂重塑肿瘤免疫微环境，促M1型巨噬细胞、CD8效应T细胞浸润，抑制M2型巨噬细胞与调节性T细胞，在H22荷瘤小鼠体内显著抑制肿瘤生长、延长生存期。研究建立巨噬细胞冷冻伪装活菌递送新策略，为安全高效细菌肿瘤疗法提供全新方案。
关键词
减毒沙门氏菌VNP20009；巨噬细胞；液氮冷冻冲击；肿瘤靶向递送；细菌免疫治疗；肿瘤微环境；中性粒细胞清除；M1/M2巨噬细胞；CD8+效应T细胞；Bioscreen生长动力学
研究目的
1. 构建液氮冷冻冲击载沙门氏菌巨噬细胞递送体系，验证冷冻处理对巨噬细胞致病性、胞内细菌活性的影响。
2. 利用芬兰Bioscreen C仪器定量检测游离与巨噬释放沙门氏菌生长曲线，明确冷冻处理对菌株增殖能力无干扰。
3. 体外共培养实验验证LNT MACS/VNP规避中性粒细胞捕获、清除的保护机制。
4. 体内荧光成像、菌落计数评估制剂肿瘤靶向富集效率，对比游离菌、简单混合组的分布差异。
5. 解析该递送体系对肿瘤免疫微环境重塑作用，定量各类抗肿瘤/免疫抑制免疫细胞比例变化。
6. 在小鼠肝癌模型评价制剂抑瘤效果与全身生物安全性，明确该策略临床转化潜力。
研究思路
1. 细胞与菌株共培养：RAW264.7巨噬细胞与VNP20009共孵育，庆大霉素清除胞外菌获得活载菌巨噬细胞；液氮速冻12h制备冷冻冲击LNT MACS/VNP。
2. 细菌生长检测：使用芬兰Bioscreen C微孔检测仪，37℃连续30h监测正常菌株、巨噬释放菌株OD600生长曲线，对比增殖差异。
3. 体外中性粒细胞共培养：分别将LNT MACS/VNP、菌+细胞简单混合组与腹腔中性粒细胞共孵育，检测活菌留存率、NETs、ROS水平。
4. 细胞表型验证：电镜、荧光观察冷冻前后细胞完整度；皮下注射验证冷冻巨噬无体内成瘤风险；Western检测CD11b、CCR2趋化受体表达。
5. 体内生物分布：DiR标记巨噬、Lux发光菌株尾静脉给药，活体成像观察肿瘤富集；多脏器匀浆菌落计数定量细菌分布。
6. 体内疗效与安全：构建H22皮下荷瘤小鼠，分生理盐水、单纯巨噬、游离菌、简单混合、LNT MACS/VNP五组给药，记录肿瘤体积、生存期；检测肝损伤生化指标、脏器病理切片评价毒性。
7. 肿瘤免疫检测：流式分析瘤内CD8+Teff、Treg、M1/M2巨噬、树突细胞、中性粒细胞比例；ELISA检测瘤内TNF-α、IFN-γ炎症因子。
研究亮点
1. 首次提出液氮冷冻冲击灭活巨噬载体策略，细胞丧失体内致瘤性但保留肿瘤趋化能力，胞内沙门氏菌活性不受影响，实现安全伪装递送。
2. 借助Bioscreen高通量生长定量直接证明冷冻、巨噬包裹不改变沙门氏菌增殖、感染能力，排除菌株活力干扰变量。
3. 巨噬细胞膜屏障隔绝细菌免疫原，显著抑制外周中性粒细胞活化与胞外菌清除，大幅提升肿瘤内细菌富集倍数。
4. 该递送体系可系统性重塑抗肿瘤微环境，同步提升效应T、M1巨噬，降低免疫抑制细胞，双重提升抑瘤效果。
5. 相比直接注射活菌，制剂肝损伤、全身炎症副作用显著降低，兼顾疗效与生物安全性，解决细菌疗法核心矛盾。
可延伸的方向
1. 利用Bioscreen平台高通量筛选冷冻保护剂，优化巨噬-细菌保存稳定性。
2. 改造VNP菌株表达PD-L1纳米抗体、促凋亡毒素，提升瘤内免疫激活效果。
3. 开展原位肝癌、肿瘤转移动物模型，验证制剂广谱抗肿瘤能力。
4. 修饰巨噬表面靶向分子，进一步提升肿瘤组织特异性富集。
5. 开发冻干制剂，简化储存与临床给药流程。
6. 联合免疫检查点抑制剂，探究协同抗肿瘤联合治疗方案。
测量的数据及研究意义
1. Bioscreen连续30h沙门氏菌生长OD曲线，研究意义：量化正常菌株与巨噬释放菌株生长速率完全一致，证实液氮冷冻、巨噬包裹不会损伤细菌增殖活力，后续体内抑瘤差异仅由递送载体伪装效应导致。
2. 扫描电镜、透射电镜、荧光细胞形态图像，数据来源图1，研究意义：直观证明冷冻冲击后巨噬细胞膜结构完整，胞内沙门氏菌稳定留存，同时皮下注射无肿块生成，验证载体安全灭活效果。
3. 中性粒细胞共培养活菌率、NETs、ROS定量，数据来源图3，研究意义：明确巨噬包裹可屏蔽细菌表面抗原，减少中性粒细胞活化与杀菌作用，解释体内肿瘤高富集机制。
4. CD11b、CCR2蛋白Western与流式数据，研究意义：冷冻巨噬完整保留肿瘤趋化关键整合素与趋化受体，保证靶向归巢能力不丢失。
5. 活体荧光成像、脏器细菌CFU计数，数据来源图3，研究意义：LNT MACS/VNP组肿瘤细菌载量是游离菌组十余倍，肝肾正常组织细菌定植显著减少，靶向性与安全性同步提升。
6. 小鼠肿瘤生长曲线、肿瘤重量、生存期统计，数据来源图5，研究意义：单剂静脉给药即可显著抑制H22肿瘤增殖，延长小鼠生存周期，证明体内实际抗肿瘤效力。
7. 肝组织病理、血清ALT/AST炎症因子检测数据，数据来源图4，研究意义：相比游离活菌组，LNT MACS/VNP处理小鼠肝脏炎症病灶、肝损伤指标大幅下降，全身毒副作用可控。
8. 肿瘤浸润免疫细胞流式、细胞因子ELISA数据，数据来源图6，研究意义：LNT MACS/VNP显著提升CD8+效应T、成熟树突、M1型巨噬占比，下调Treg与M2抑制型细胞，重塑抗肿瘤免疫微环境。
结论
1. 液氮速冻处理载VNP巨噬细胞可获得“结构完整、无体内致病性”递送载体，胞内减毒沙门氏菌增殖活性不受冷冻损伤，Bioscreen生长实验证实菌株功能完整。
2. 巨噬细胞包膜形成生物伪装屏障，阻断沙门氏菌暴露引发的外周中性粒细胞激活与清除，大幅提高细菌向肿瘤组织靶向富集水平。
3. LNT MACS/VNP静脉给药后不会造成明显肝损伤与全身性炎症，相比直接注射活菌生物安全性显著提升。
4. 冷冻巨噬递送的沙门氏菌在肿瘤内延迟释放，通过重塑肿瘤免疫微环境，上调IFN-γ、TNF-α等抗肿瘤因子，有效抑制小鼠皮下H22肝癌生长、延长动物生存期。
5. 巨噬细胞冷冻冲击策略兼顾活菌疗法靶向效率与体内安全缺陷，为实体瘤靶向细菌免疫治疗提供全新可转化递送平台。
6. 该体系具备改造工程菌、联合免疫药物、冻干制剂开发多重拓展潜力，可延伸至多种实体瘤的微生物免疫干预研究。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 采用Bioscreen C 96孔蜂窝微孔高通量体系，同步设置野生VNP、巨噬释放VNP多生物学重复，37℃恒温持续振荡，每30min自动读取OD600，连续30h完整记录细菌全生长周期。
2. 全程自动化密闭检测，无需多次开盖转移菌液，避免低温处理后细菌污染、温度波动带来实验偏差，各组生长曲线可比性强。
3. 本实验核心对照需求：排除液氮冷冻、巨噬胞内环境损伤细菌活力，Bioscreen连续时序OD数据直观证明两组菌株生长无统计学差异，确定体内抑瘤差异完全来自巨噬伪装递送优势，而非细菌活性变化。
4. 微量LB培养体系大幅节约菌株、培养基耗材，无需分批平板菌落计数，批量完成菌株活力验证，缩短体外预实验周期。
5. 仪器输出标准化连续数值，可直接导入GraphPad做方差分析，消除肉眼判读生长强弱主观误差，为菌株功能完整提供定量客观证据。
6. Bioscreen生长动力学结果与细胞形态、中性粒细胞体外实验、体内肿瘤疗效多层次数据交叉印证，构建“冷冻巨噬包裹不损伤细菌→体内躲避免疫清除→肿瘤高富集→重塑免疫抑瘤”完整证据链。