Vancomycin heteroresistance caused by unstable tandem amplifications of the vanM gene cluster on linear conjugative plasmids in a clinical Enterococcus faecium
临床屎肠球菌线性接合质粒上vanM基因簇不稳定串联扩增介导万古霉素异质性耐药
来源：Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Volume 68, Issue 5, May 2024, 《抗菌药物与化学治疗》，第68卷第5期，2024年5月，DOI: 10.1128/aac.01159-23
摘要
万古霉素异质性耐药菌株常规药敏检测易漏检，会造成临床抗感染治疗失败。本研究从临床分离一株携带完整vanM耐药基因簇但微量肉汤法检测为万古霉素敏感的屎肠球菌SRR12，E-test抑菌圈中可长出耐药亚克隆SRR12-v1，群体分析法（PAP）证实该菌株存在异质性耐药；SRR12在2–32 mg/L万古霉素环境下生长曲线存在13 h以上超长迟滞期。亲本SRR1与耐药亚克隆vanM基因序列无突变差异，但耐药株vanM基因拷贝数显著升高。长读长全基因组测序显示SRR1的单拷贝vanM位于pELF1类线性接合质粒上，耐药株质粒中IS1216E介导vanM基因簇串联扩增；梯度传代实验证实该扩增不稳定：无万古霉素/递增药物压力下拷贝数下降、菌株适应性恢复，恒定治疗浓度万古霉素下扩增相对稳定。接合实验与S1脉冲场凝胶电泳证实携带扩增片段的线性质粒可水平转移，大幅提升万古霉素耐药扩散风险。本研究阐明vanM基因簇不稳定串联扩增是屎肠球菌万古霉素异质性耐药的分子机制，为临床耐药筛查与感染防控提供理论依据。
关键词
屎肠球菌；万古霉素；异质性耐药；vanM基因簇；线性接合质粒；IS1216E插入序列；长读长测序；基因串联扩增；耐药基因水平转移；细菌适应性代价
研究目的
1. 鉴定临床屎肠球菌SRR1的万古霉素异质性耐药表型，明确常规药敏方法漏检原因。
2. 解析SRR1及其高耐药亚克隆SRR1-v1的vanM基因拷贝、质粒结构差异，挖掘异质性耐药分子基础。
3. 借助长读长测序定位vanM基因簇在质粒上的位置，阐明IS1216E介导串联扩增的形成机制。
4. 探究不同万古霉素压力（无药、恒定浓度、递增浓度）下vanM扩增拷贝数与菌株适应性的动态变化，评估扩增稳定性。
5. 验证携带扩增vanM的线性质粒接合转移能力，评估耐药基因水平传播风险。
6. 为临床异质性耐药菌株快速检测、院内VRE防控提供分子实验支撑。
研究思路
1. 菌株表型鉴定：微量肉汤MIC、E-test、PAP群体分析、Bioscreen生长曲线测定，确认SRR1异质性耐药特征与超长迟滞生长特点。
2. 分型与基础测序：MLST分型，qPCR定量SRR1与耐药亚克隆van、rep基因拷贝，RT-qPCR检测vanM转录表达差异。
3. 质粒全长解析：Illumina短读+Nanopore长读联合组装，比对pELF1参考质粒，结合SmaI/S1-PFGE、Southern杂交验证线性质粒结构。
4. 扩增机制溯源：分析长读原始序列中vanM串联片段，明确IS1216E介导复制转座形成多拷贝阵列。
5. 传代稳定性实验：设置无药、恒定16 mg/L、递增万古霉素三组连续50代传代，qPCR测拷贝、生长速率评估适应性变化。
6. 接合转移实验：滤膜交配实验获得接合子，PFGE与测序验证质粒可转移、转移后质粒长度随vanM扩增片段改变。
研究亮点
1. 首次证实线性接合质粒上IS1216E介导vanM基因簇不稳定串联扩增是屎肠球菌万古霉素异质性耐药核心机制。
2. 利用芬兰Bioscreen仪器捕捉异质性耐药菌株特征性超长迟滞生长曲线，解释临床自动化药敏漏检根源。
3. 长读长测序直接捕获含16个vanM串联拷贝的超长读段，直观证明质粒上多拷贝阵列的存在与复制中间体结构。
4. 三组传代对照完整揭示扩增稳定性规律：恒定临床治疗浓度可维持拷贝，无药/升药压力下拷贝衰减、适应性回升。
5. 证实携带多拷贝vanM的可变长度线性质粒可高效接合转移，提示异质性耐药菌株具备院内暴发传播潜力。
6. 结合临床病例说明异质性耐药漏检会直接导致治疗失败，突出该类菌株临床检测必要性。
可延伸的方向
1. 开发靶向vanM多拷贝扩增的荧光定量PCR快速检测试剂盒，建立临床常规筛查方案。
2. 筛选抑制IS1216E转座的小分子化合物，阻断vanM串联扩增，消除异质性耐药潜力。
3. 扩大临床菌株样本量，统计国内vanM型异质性耐药屎肠球菌流行率与院内传播特征。
4. 动物感染模型验证SRR1及其耐药亚克隆体内增殖、感染能力差异。
5. 探究万古霉素联合其他抗菌药物是否抑制vanM基因扩增，优化联合抗感染方案。
6. 对比vanA、vanB、vanM三型肠球菌异质性耐药分子通路差异。
测量的数据及研究意义
1. 药敏MIC、E-test抑菌圈亚菌落、PAP菌群计数数据，数据来源：图1；研究意义：直观证明SRR1表型矛盾：标准方法判为敏感，菌群内存在超高MIC耐药亚群，解释临床检测假阴性风险。
2. Bioscreen动态生长OD600、迟滞时长数据，数据来源：图1C；研究意义：量化万古霉素浓度越高菌株迟滞期越长，特征生长曲线可作为异质性耐药快速初筛指标。
3. qPCR基因拷贝、vanM转录表达数据，数据来源：表1；研究意义：明确耐药亚克隆vanM拷贝与表达量大幅上升，rep质粒拷贝无明显变化，证明耐药源于基因串联扩增而非质粒复制增多。
4. 长读长质粒组装、序列比对、PFGE-Southern杂交条带数据，数据来源：图2、图3、图4；研究意义：定位vanM位于pELF1类线性质粒，IS1216E介导相邻拷贝串联，解释扩增分子骨架与结构特征。
5. 三代测序原始长读vanM多拷贝片段数据，数据来源：图4B；研究意义：直接捕获含多个串联拷贝的天然质粒读段，实锤IS1216E复制转座产生扩增中间体。
6. 三代传代后vanM拷贝、菌株生长适应性数据，数据来源：图5；研究意义：证实扩增存在显著适应性代价，拷贝随药物压力动态调整，解释停药后菌株毒力恢复现象。
7. 接合子PFGE条带、质粒比对数据，数据来源：图3、图6；研究意义：线性质粒可稳定接合转移，转移后质粒长度随vanM扩增片段改变，存在耐药扩散隐患。
结论
1. 临床ST78型屎肠球菌SRR1携带完整vanM基因簇，标准微量肉汤药敏判定敏感，但存在低频率超高耐药亚群，属于典型万古霉素异质性耐药菌株。
2. 异质性耐药的分子根源为pELF1类线性接合质粒上IS1216E介导vanM基因簇发生不稳定串联扩增，拷贝数上升同步提升vanM转录水平，赋予菌株高耐药表型。
3. vanM串联扩增存在明显适应性代价；无万古霉素或梯度升药连续传代后拷贝数下降、菌株生长适应性恢复；维持临床恒定万古霉素浓度可稳定保留扩增拷贝。
4. 携带vanM多拷贝阵列的线性接合质粒具备高效接合转移能力，转移后质粒大小随扩增片段长度变化，会造成院内万古霉素耐药肠球菌扩散风险。
5. 常规自动化药敏、E-test易漏检该类异质性耐药菌株，PAP菌群分析是鉴定金标准，但操作繁琐，亟需开发快速临床检测手段。
6. IS1216插入序列是调控vanM扩增、驱动异质性耐药、促进耐药基因水平传播的关键靶点，可作为新型抗耐药干预靶点。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 24小时全自动每5分钟采集OD600吸光度，完整记录SRR1在不同万古霉素浓度下完整生长周期，精准量化13–19 h超长迟滞期这一异质性耐药标志性特征，单点终点MIC检测无法捕捉该特征。
2. 统一37℃恒温振荡密闭培养环境，消除人工分批孵育、移液带来的温度、污染误差，空白、敏感对照、耐药对照与待测菌株数据平行可比，可靠区分异质性耐药菌株独特生长模式。
3. 96孔高通量体系同步设置多梯度万古霉素浓度，一次性完成0–32 mg/L全浓度生长曲线测定，快速定位产生迟滞生长的最低药物阈值，简化表型筛选流程。
4. 动态生长数据与PAP菌落计数、E-test结果交叉印证，建立“超长迟滞生长”与“菌群内耐药亚群存在”的对应关系，为简易初筛提供量化指标。
5. 微量体系大幅降低万古霉素试剂用量，同时设置多生物学重复，减少昂贵抗菌药物消耗，适合大量临床分离株批量异质性耐药初筛。
6. 仪器配套软件自动输出迟滞期、最大OD、生长速率量化参数，可实现标准化数值对比，避免人工肉眼判读带来主观偏差，利于不同菌株间生长特征横向对比。