Characterization of Yeast Isolated from the Gut Microbiota of Tunisian Children with Autism Spectrum Disorder
突尼斯自闭症谱系障碍儿童肠道微生物群中分离酵母菌的特征
来源：J. Fungi, Volume 10, Article ID 730, 2024,《真菌期刊》，第10卷，文章编号730，2024年，DOI: 10.3390/jof10110730
摘要
目前自闭症肠脑轴相关研究多聚焦细菌，肠道真菌的研究十分匮乏。本研究旨在调查突尼斯自闭症（ASD）儿童肠道念珠菌定植率、菌种分布、抗真菌药敏特征与毒力因子。研究纳入28名自闭症儿童与46名匹配对照儿童，采集粪便分离念珠菌，通过生化与分子方法鉴定菌种，采用EUCAST微量肉汤稀释法开展药敏测试，体外检测生物膜形成、细胞表面疏水性、磷脂酶与蛋白酶四类毒力指标。结果显示，自闭症儿童念珠菌检出率46.4%，对照组30.4%，两组无统计学差异；白念珠菌为两组最常见分离菌种。药敏结果中3.7%菌株对两性霉素B、阿尼芬净耐药，22.2%对米卡芬净耐药，18.5%对氟康唑耐药；全部分离株均可形成生物膜。毒力检测结果：仅14.8%菌株产磷脂酶，29.6%产天冬氨酸蛋白酶，33.3%菌株具备高疏水性。研究证实自闭症儿童肠道普遍存在念珠菌定植，菌株兼具多重毒力因子与耐药表型，提示需进一步研究肠道念珠菌与自闭症发病的潜在关联。
关键词
自闭症谱系障碍；肠道真菌；念珠菌；抗真菌药敏；毒力因子；生物膜；细胞疏水性；磷脂酶；蛋白酶；肠脑轴
研究目的
1. 对比突尼斯自闭症儿童与健康对照儿童粪便中念珠菌的定植阳性率与菌种构成差异。
2. 分析分离得到的全部念珠菌对六种临床常用抗真菌药物的体外耐药表型。
3. 体外定量检测念珠菌四大核心毒力特征：生物膜生成能力、细胞表面疏水性、磷脂酶、天冬氨酸蛋白酶分泌活性。
4. 探究肠道念珠菌定植、胃肠道症状、自闭症严重程度三者之间的关联关系。
5. 为肠道真菌与自闭症发病关联研究、儿童肠道真菌感染临床用药提供体外实验数据支撑。
研究思路
1. 受试人群招募与临床信息采集：筛选4–10岁28名ASD患儿、46名年龄匹配健康儿童，记录性别、年龄、胃肠道症状、CARS自闭症严重程度评分，排除近1个月使用抗真菌/抗生素/益生菌的受试者。
2. 粪便酵母菌分离鉴定：粪便样本接种沙堡培养基培养，通过显色培养基、API生化试剂盒初筛，HWP1基因PCR分子区分白念珠菌、都柏林念珠菌、非洲念珠菌。
3. 抗真菌药敏实验：依据EUCAST标准微量肉汤稀释法，检测两性霉素B、米卡芬净、阿尼芬净、氟康唑、艾沙康唑、伊布曲芬的MIC值，判定耐药、中介、敏感菌株。
4. 毒力表型检测：
（1）BioScreen仪器定量结晶紫、XTT法检测24/48h生物膜生物量与代谢活性；
（2）MATH法测定菌体细胞表面疏水性；
（3）蛋黄平板测磷脂酶、BSA平板测天冬氨酸蛋白酶分泌活性。
5. 统计学分析：采用卡方、t检验、曼惠特尼非参数检验对比两组临床、真菌相关数据，p<0.05判定差异显著。
研究亮点
1. 首个系统完成突尼斯自闭症儿童肠道念珠菌菌种、药敏、全套毒力特征一体化研究，填补区域自闭症肠道真菌数据空白。
2. 同时检测6种主流抗真菌药物耐药情况，发现氟康唑、米卡芬净耐药菌株占比偏高，提示自闭症患儿肠道念珠菌存在临床用药风险。
3. 利用芬兰BioScreen仪器高通量动态定量生物膜总量与代谢活力，精准区分高/中/低产膜菌株，证实白念珠菌产膜能力显著强于非白念珠菌。
4. 关联分析证实自闭症严重程度与便秘高度相关，但念珠菌定植与否和ASD严重度、胃肠道症状无显著关联。
5. 多维度毒力实验证实分离念珠菌均具备生物膜形成能力，部分菌株分泌水解酶、高疏水性，具备肠道潜在致病潜力。
可延伸的方向
1. 扩大样本量，纳入多地区自闭症儿童，结合宏基因组测序全面解析肠道真菌组整体结构，不局限于可培养念珠菌。
2. 开展动物肠脑轴模型，验证念珠菌定植是否诱发自闭症样行为、肠道炎症。
3. 探究饮食（高糖等）对儿童肠道念珠菌丰度、毒力表达的调控作用。
4. 研究益生菌/益生元干预抑制肠道念珠菌定植、降低毒力的效果。
5. 开展纵向随访，观察自闭症患儿念珠菌定植变化与病情波动的相关性。
6. 针对耐药念珠菌，筛选天然植物来源抗真菌活性物质，开发儿童安全抑菌制剂。
测量的数据及研究意义
1. 受试者人口学、胃肠道症状、自闭症严重程度统计数据，数据来源：表1、图1；研究意义：明确自闭症儿童便秘发生率显著高于对照组，且便秘、消化道不适与自闭症严重程度正相关，建立肠道症状与疾病严重程度的临床关联。
2. 两组儿童粪便念珠菌检出率、菌种分布数据，数据来源：图2；研究意义：自闭症儿童念珠菌定植率更高但无统计学差异，白念珠菌为优势菌种，同时检出光滑、副念珠菌等多种非白念珠菌，完善区域儿童肠道真菌基线数据。
3. 六种抗真菌药物MIC、菌株耐药分布数据，数据来源：表2；研究意义：量化各类念珠菌耐药比例，氟康唑、米卡芬净耐药问题突出，伊布曲芬体外抑菌活性优异，为儿童肠道念珠菌感染临床选药提供依据。
4. BioScreen测得生物膜结晶紫OD、XTT代谢荧光值，数据来源：表3；研究意义：全部念珠菌均可形成生物膜，白念珠菌产膜能力显著更强，生物膜会提升真菌耐药与侵袭能力，提示肠道念珠菌具备持续定植致病潜力。
5. 细胞表面疏水性百分比数据，数据来源：图3；研究意义：自闭症来源菌株中等疏水性比例更高，高疏水性利于真菌黏附肠道黏膜，是重要致病相关毒力特征。
6. 磷脂酶、蛋白酶分泌活性分级统计数据，数据来源：表4；研究意义：仅小部分菌株分泌水解酶，说明肠道念珠菌以共生状态为主，但仍存在一定侵袭毒力，具备潜在致病风险。
结论
1. 突尼斯自闭症儿童肠道念珠菌定植率高于健康儿童，但两组定植率、菌种分布无统计学显著差异；白念珠菌为两组粪便中最常见酵母菌。
2. 自闭症患儿念珠菌耐药现象普遍，氟康唑、米卡芬净耐药菌株占比高，新型药物伊布曲芬对所有测试菌株均表现良好体外抑菌效果。
3. 所有分离念珠菌均能形成生物膜，白念珠菌生物膜生成能力显著优于其他念珠菌；自闭症来源菌株细胞疏水性整体更高，但磷脂酶、蛋白酶分泌菌株占比较低。
4. 自闭症严重程度与便秘、消化道紊乱显著相关，但肠道念珠菌定植与否和患儿消化道症状、自闭症严重程度无明显关联。
5. 仅依靠分离培养法无法完整反映自闭症儿童肠道真菌全貌，后续需结合高通量测序开展肠道真菌组深度研究，进一步验证念珠菌与自闭症发病的因果关系。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 高通量96孔体系可同步批量检测多菌株、多重复样本24h与48h两个时间节点生物膜OD值，大幅提升生物膜定量实验效率，减少人为操作误差。
2. 自动稳定读取600nm（结晶紫生物量）、492nm（XTT代谢活性）双波长吸光值，实现生物膜总量与活菌代谢水平双维度精准量化，区分膜体积与膜内活性细胞两种指标。
3. 全程恒温密闭检测环境，避免孵育、移液过程带来的温度、污染干扰，保证ASD组与对照组念珠菌生物膜数据平行可比，可靠对比两组菌株产膜能力差异。
4. 连续长时间静置孵育适配念珠菌生物膜缓慢形成的生长特征，完整捕捉24h、48h成熟生物膜阶段，避免单点检测造成数据偏差。
5. 微量体系大幅节约培养基、染色试剂，针对大量临床分离菌株开展批量毒力筛选，降低实验耗材成本。
6. 标准化数值输出便于统一划分高/中/低产膜菌株等级，客观证实白念珠菌相较于非白念珠菌拥有更强生物膜形成毒力，为后续致病机制研究提供定量表型支撑。