Human saliva modifies growth, biofilm architecture, and competitive behaviors of oral streptococci
人类唾液改变口腔链球菌的生长、生物膜结构与竞争行为
来源：mSphere, Volume 9, Issue 2, February 2024, 《mSphere》，第9卷第2期，2024年2月，DOI:10.1128/msphere.00771-23
摘要
本研究聚焦牙菌斑生物膜内变形链球菌（致龋菌）与口腔共生链球菌的种间互作，既往相关实验均未添加人体唾液，与口腔真实微环境存在偏差。研究先单独检测8种链球菌在含唾液培养基中的生长与生物膜形成：唾液可提升菌株生长速率，但降低生物膜总生物量、重塑生物膜空间结构；该规律在29株唾液分离野生菌株中同样成立。共培养竞争实验发现，唾液会增强变形链球菌对共生链球菌的竞争能力，提升其生物膜微菌落体积。通过RNA测序对比有无唾液条件下变形链球菌与口腔链球菌单培养、共培养转录组，证实两菌在混合培养中分化出独立营养生态位：变形链球菌上调碳水化合物摄取利用通路，口腔链球菌上调多肽摄取与聚糖分解相关基因；变形链球菌同时上调锰转运等抗氧化应激基因，外源补充锰离子可进一步强化其竞争优势。研究证实宿主唾液组分通过调控微生物代谢与抗逆通路，改变口腔致病菌与共生菌的竞争格局，为调控致龋菌定植、维持口腔有益菌群提供新靶点。
关键词
微生物种间互作；生物膜；口腔生物学；微生物竞争；人体体液；链球菌
研究目的
1. 既往体外实验缺乏唾液模拟口腔原生环境，无法真实反映变形链球菌与共生链球菌的互作规律，本研究明确人体唾液对口腔链球菌单独生长、生物膜结构的影响。
2. 探究唾液是否改变变形链球菌与共生链球菌的竞争行为，揭示背后转录调控机制。
3. 解析两种链球菌在唾液环境下的营养生态位分化特征，明确碳水化合物、金属离子对二者竞争平衡的调控作用。
4. 挖掘可干预口腔菌群平衡的分子靶点，开发既能抑制致龋变形链球菌、又保留有益共生菌群的防龋新策略。
研究思路
1. 体外培养基优化：设置TY基础培养基、TY-水对照、TY-唾液混合培养基，筛选50%TY+50%唾液为最优模拟口腔培养体系，同时搭配化学限定培养基CDM验证结果普适性。
2. 单菌株表型检测：8株标准口腔链球菌+29株唾液野生分离株，分别测定生长动力学、结晶紫生物膜总量、荧光显微成像生物膜三维结构。
3. 共培养竞争实验：构建GFP标记变形链球菌荧光定量竞争体系、CFU竞争指数实验，对比有无唾液时变形链球菌对多种共生链球菌的竞争强弱。
4. 转录组测序分析：分别完成有无唾液条件下变形链球菌、口腔链球菌单培养、共培养RNA-seq，筛选差异表达基因，划分功能通路。
5. 机制验证：外源添加不同单糖/双糖、铁/锰/锌金属离子，验证碳水化合物代谢、锰离子转运通路对菌株竞争优势的调控作用。
研究亮点
1. 首次在贴近口腔生理的唾液培养体系中系统对比标准菌株与临床唾液野生分离株，验证唾液对口腔链球菌生长、生物膜、种间竞争的统一调控规律，弥补无唾液体外模型的缺陷。
2. 证实唾液会反向强化致龋菌变形链球菌的竞争能力，颠覆“唾液可抑制致病菌”的常规认知，阐明唾液介导的致病菌竞争优势分子机制。
3. 转录组证明变形链球菌与口腔链球菌在唾液中发生营养生态位分离：变形链球菌偏好各类单糖、二糖摄取，共生链球菌主导唾液糖蛋白降解，二者碳源利用通路无明显重叠。
4. 发现锰离子转运通路是变形链球菌在唾液中抵御共生菌过氧化氢氧化杀伤的关键，外源锰可人工调控菌群竞争平衡，提供防龋干预新靶点。
5. 多维度实验体系整合：生长动力学、生物膜显微定量、荧光实时竞争、CFU计数、转录组、营养/金属离子干预，多层面交叉验证结论可靠性。
可延伸的方向
1. 筛选唾液中调控链球菌代谢与竞争的活性组分（黏蛋白、多肽、微量金属、寡糖），单独验证单一唾液成分的作用。
2. 构建多菌种复合牙菌斑生物膜模型（放线菌、罗氏菌等），探究唾液对复杂口腔菌群群落结构的长期调控。
3. 靶向变形链球菌碳水化合物PTS转运系统、锰转运slo/mntH通路开发小分子抑制剂，体外/动物模型验证防龋效果。
4. 探究唾液AI-2群体感应分子、黏蛋白聚糖对链球菌基因表达的调控网络。
5. 开展人体临床试验，检测不同唾液组分、锰含量人群口腔变形链球菌丰度与龋齿发病的关联。
6. 研究锌离子调控共生链球菌竞争优势的分子通路，开发促有益菌定植的口腔护理制剂。
测量的数据及研究意义
1. 生长动力学数据（倍增时间、最终OD600产量、延迟期时长），数据来源：图1、图3；研究意义：明确唾液能加速绝大多数口腔链球菌生长，确定50%唾液混合培养基为最优体外模拟体系，同时证实唾液对野生分离株、放线菌等非链球菌同样具备促生长效应，证明该现象具有广谱性。
2. 生物膜定量数据（结晶紫总生物量、细胞生物量、eDNA基质、葡聚糖基质、生物膜厚度、微菌落体积），数据来源：图2、图3；研究意义：唾液整体降低多数链球菌生物膜附着量，但特异性强化远缘链球菌生物膜形成，说明唾液对生物膜结构的调控具有菌种特异性，唾液黏蛋白会削弱细菌表面黏附能力。
3. 共培养竞争荧光AUC值、CFU竞争指数数据，数据来源：图4、图5；研究意义：直接证明唾液显著提升变形链球菌对口腔链球菌、血链球菌等共生菌的竞争优势，生物膜内变形链球菌生物量显著升高，解释唾液环境下龋齿致病菌易过度增殖的病理现象。
4. RNA-seq差异表达基因数据、PCA主成分分析、火山图通路富集数据，数据来源：图6、图7；研究意义：从转录层面揭示唾液重塑两种链球菌代谢通路，二者形成互不重叠的营养生态位；变形链球菌上调锰转运、抗氧化、多种糖摄取基因，是其竞争取胜的分子基础。
5. 不同碳水化合物添加后的竞争指数数据，数据来源：图8B；研究意义：半乳糖、甘露糖、海藻糖、纤维二糖可进一步放大变形链球菌竞争优势，果糖、乳糖、麦芽糖无明显作用，证明碳源种类直接调控菌群竞争平衡。
6. 外源金属离子干预竞争指数数据，数据来源：图8D；研究意义：锰离子特异性增强变形链球菌竞争力，锌离子利于共生菌，铁离子无作用，明确唾液微量锰是变形链球菌抵御氧化应激、占据优势的关键微量元素。
结论
1. 人体唾液可提升口腔链球菌浮游生长速率，但普遍降低多数菌种生物膜生物量与附着能力，仅远缘链球菌生物膜被唾液促进；该表型在实验室标准菌株与临床唾液野生分离株中保持一致。
2. 唾液会显著增强变形链球菌对多数共生口腔链球菌的种间竞争能力，共培养生物膜内变形链球菌微菌落体积、总生物量显著上升。
3. 唾液诱导两种链球菌分化独立营养生态位：变形链球菌高表达各类单糖、二糖转运通路，口腔链球菌高表达唾液糖蛋白、多肽降解基因，二者碳源利用不存在激烈竞争。
4. 唾液环境下变形链球菌锰摄取通路显著上调，锰通过提升抗氧化应激能力赋予其竞争优势，外源补充锰可人工强化该效应，锌离子则逆转竞争平衡、利于共生链球菌。
5. 唾液通过全局重编程链球菌转录组改变菌群互作，忽略唾液的体外实验会严重偏离口腔真实菌群互作规律，体外龋病研究必须引入唾液模拟生理环境。
6. 靶向变形链球菌特异性糖转运、锰代谢通路，可开发不破坏有益共生菌群的新型防龋干预手段。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
芬兰Bioscreen C MBR全自动浊度分析仪用于24小时每30分钟连续记录OD600数值，以此计算菌株倍增时间、最终生长产量、生长延迟期，其测量数据具备多重核心研究意义：
1. 实现高通量、长时间动态监测多株链球菌在有无唾液、不同唾液比例培养基中的完整生长曲线，克服终点单时间点取样无法捕捉生长全过程的缺陷，精准量化唾液对细菌生长三个关键阶段（延迟期、对数期、稳定期）的差异化调控。
2. 仪器自动避光、矿物油封板厌氧培养，完全匹配口腔链球菌微需氧生长需求，减少人工操作带来的污染、氧气干扰误差，保证生长动力学数据重复性与可靠性，为筛选50%唾液最优培养体系提供定量依据。
3. 同时并行检测8株标准链球菌、29株野生唾液分离株的生长参数，批量对比不同菌种对唾液的生长响应差异，证实唾液促生长效应是口腔微生物广谱特征，不局限于变形链球菌。
4. 生长曲线数据作为基础表型，为后续生物膜实验、共培养竞争实验设置统一标准化接种浓度与培养条件，保证全实验体系变量单一，排除生长速率差异对生物膜、竞争结果的干扰。
5. 区分唾液促浮游生长与抑制生物膜附着两种相反表型，通过动态OD数据证明唾液仅提升浮游细菌增殖，不会同步促进生物膜累积，厘清唾液对细菌两种生存形态的不同调控作用。
6. 分别在TY培养基、CDM化学限定培养基中完成Bioscreen生长检测，验证唾液促生长效应不依赖特定基础培养基，证明该生理效应具有普适性，实验结论不受培养基配方干扰。