全自动生长曲线分析仪

Multimodal vaccination targeting the receptor binding domains of Clostridioides difficile toxins A and B with an attenuated Salmonella Typhimurium vector (YS1646) protects mice from lethal challenge

利用减毒鼠伤寒沙门氏菌载体（YS1646）靶向艰难梭菌毒素A、B受体结合域的多模式疫苗可保护小鼠免受致死攻击

来源：Microbiology Spectrum, February 2024, Volume 12, Issue 2, DOI:10.1128/spectrum.03109-22

《微生物学谱》，2024年2月，第12卷第2期，DOI:10.1128/spectrum.03109-22

摘要

艰难梭菌感染（CDI）是重大公共卫生问题，仅肌注重组毒素疫苗的三期临床试验均未达到主要疗效终点，推测仅诱导体液免疫缺乏肠道黏膜保护是失败核心原因。本研究改造曾用于癌症治疗的减毒鼠伤寒沙门氏菌YS1646，将艰难梭菌毒素A、B的受体结合域（rbdA/rbdB）基因定点整合至细菌染色体attTn7位点，构建稳定无抗性疫苗菌株；设计肌注重组抗原联合口服沙门氏菌载体的短程多模式免疫方案（第0天肌注，0/2/4天口服）。小鼠免疫5周后检测免疫应答与攻毒保护效果：多模式免疫可同时诱导高滴度血清IgA、IgG，提升抗体亲和力；肠系膜淋巴结IL-5分泌与IgA浆细胞数量上升；单纯肌注偏向Th2型IgG1应答，口服免疫诱导Th1型IgG2c为主的应答。低剂量免疫条件下，仅靶向TcdA口服或多模式免疫可完全抵御艰难梭菌致死攻毒；提高肌注与口服抗原剂量后，单独口服TcdA载体疫苗也能实现100%小鼠存活。研究证实YS1646安全性良好，兼具全身与黏膜免疫诱导能力，为艰难梭菌新型黏膜疫苗进入一期临床提供实验支撑。

关键词

艰难梭菌；鼠伤寒沙门氏菌；减毒疫苗载体；黏膜免疫；体液免疫；毒素受体结合域；多模式免疫接种

研究目的

1. 构建染色体稳定整合rbdA、rbdB的无抗性减毒沙门氏菌YS1646疫苗株，解决质粒载体携带耐药基因、遗传不稳定无法临床应用的缺陷。

2. 验证肌注重组抗原联合口服沙门氏菌载体多模式免疫方案能否同时诱导全身体液免疫与肠道黏膜特异性免疫。

3. 对比单纯肌注、单纯口服、多模式三种免疫策略的抗体亚型、细胞因子、黏膜浆细胞差异，明确免疫应答偏向性。

4. 通过小鼠致死艰难梭菌攻毒模型，评价不同免疫方式、高低免疫剂量的保护效力。

5. 基于YS1646已有的人体一期安全数据，评估该黏膜疫苗进入临床转化的可行性。

研究思路

1. 载体菌株改造：构建携带不同启动子、分泌信号、抗原片段的Tn7整合质粒，通过接合转座将rbdA/rbdB定点插入YS1646基因组attTn7位点，Flp重组酶删除氯霉素抗性盒，PCR与测序验证整合稳定性；Western筛选体外可稳定表达抗原的菌株。

2. 体外菌株表征：使用Bioscreen全自动生长仪测定野生株与重组菌株24h生长曲线，评估基因整合对菌株生长适应性的影响；体外诱导表达重组rbdA/rbdB蛋白用于肌注免疫。

3. 小鼠分组免疫：设置PBS空白、单纯肌注重组抗原、单纯口服YS1646载体、肌注+口服多模式免疫多组，区分单毒素、双毒素免疫，设置常规剂量与高剂量两套免疫方案。

4. 免疫指标检测：免疫5周后采集血清、小肠组织检测抗原特异性IgG/IgA滴度、抗体亲和力、IgG1/IgG2亚型；分离肠系膜淋巴结、派尔集合淋巴结，检测多种细胞因子分泌与IgA分泌浆细胞数量。

5. 艰难梭菌攻毒实验：抗生素预处理破坏小鼠肠道菌群后经胃管攻毒，持续监测小鼠存活率、疾病症状评分，记录生存曲线；攻毒3周后复测肠道抗体水平。

6. 结果综合分析：整合体外菌株生长、体内免疫应答、攻毒保护数据，对比不同免疫策略优劣，分析黏膜免疫对CDI保护的关键作用，讨论临床应用前景与局限。

研究亮点

1. 首次将艰难梭菌毒素抗原稳定整合至沙门氏菌染色体，消除质粒与抗性标记安全隐患，解决此前载体无法人体试验的关键缺陷。

2. 创新多模式免疫策略，结合肌注快速诱导高滴度全身抗体、口服沙门氏菌靶向肠道黏膜双重优势，同时激活Th1+Th2混合型免疫应答。

3. 明确口服减毒沙门氏菌可特异性诱导肠道IgA应答，弥补传统肌注疫苗缺失黏膜保护的短板，解释三期疫苗临床失效机制。

4. 证实提高免疫剂量后仅口服载体疫苗即可实现小鼠100%抵抗致死艰难梭菌感染，简化未来临床给药流程。

5. 选用已完成人体一期临床试验、安全性充分验证的YS1646作为载体，大幅降低疫苗临床转化的安全评估成本。

6. 完整建立菌株构建—体外表征—多层次免疫检测—致死攻毒全链条评价体系，数据支撑黏膜疫苗优于传统肌注疫苗。

可延伸的方向

1. 对rbdA/rbdB进行蛋白结构改造，优化抗原分泌量与免疫原性，提升低剂量下保护效率。

2. 开展小鼠长期免疫实验，评估抗体与黏膜免疫持续时间，探究疫苗长效保护能力。

3. 开展双毒素联合口服单针免疫方案，简化临床接种流程，降低给药操作复杂度。

4. 小动物实验完成后推进非人灵长类动物免疫与攻毒实验，验证疫苗在高等动物保护效果。

5. 筛选小分子佐剂与口服载体联用，进一步增强肠道黏膜IgA分泌水平。

6. 探究YS1646在人体肠道定植时长、抗原表达水平，为一期临床给药频次、剂量设计提供依据。

7. 开展疫苗联合窄谱抗生素的协同预防实验，降低院内艰难梭菌复发率。

测量的数据及研究意义

1. 各重组沙门氏菌24h生长曲线OD600数据，来自图1D

研究意义：1. frr_SspH1_rbdA菌株生长速率约为野生株80%，其余重组株生长无显著损伤，证明抗原整合对菌株适应性影响极小；2. 筛选生长正常菌株用于后续动物实验，排除生长缺陷干扰免疫保护结果。

2. 小鼠血清TcdA、TcdB特异性IgG滴度、IgG亲和力、IgG1/IgG2c亚型比值，来自图2

研究意义：1. 多模式免疫组血清IgG滴度高于单纯肌注组，抗体亲和力显著提升；2. 单纯肌注以Th2型IgG1为主，口服诱导Th1偏向IgG2c，证明两种给药途径免疫通路完全不同；3. 明确多模式免疫可同步激活两类辅助T细胞应答。

3. 肠系膜淋巴结、派尔集合淋巴结细胞因子分泌量、IgA阳性浆细胞数，来自图3

研究意义：1. 多模式免疫组肠系膜淋巴结IL-5显著升高，IgA分泌浆细胞增多，IL-5可促进肠道IgA产生；2. 口服组派尔集合淋巴结GM-CSF上升，证明载体靶向肠道黏膜免疫器官；3. 直接证明口服途径是诱导黏膜免疫的核心条件。

4. 小鼠小肠抗原特异性IgA滴度数据，来自图3C

研究意义：单纯肌注几乎无法诱导肠道IgA，含口服免疫组别IgA显著上升，阐明传统疫苗缺失肠道保护的核心缺陷，黏膜IgA是抵御肠道艰难梭菌的关键防线。

5. 艰难梭菌攻毒后小鼠生存曲线、每日疾病症状评分，来自图4

研究意义：1. 常规剂量下仅TcdA单免疫可实现完全保护，双毒素单纯口服无保护效果；2. 提升免疫剂量后，单独口服TcdA载体即可100%保护，证明剂量是黏膜保护关键变量；3. 多模式双毒素免疫小鼠存活率94，症状最轻，是最优免疫方案。

6. 攻毒后小鼠血清、肠道抗体复测数据

研究意义：攻毒可再次提升体内抗体水平，疫苗诱导免疫具备记忆应答，感染后可快速启动体液防御。

结论

1. 通过Tn7定点整合与Flp重组酶去除抗性标记，成功构建染色体稳定表达rbdA、rbdB的减毒沙门氏菌YS1646疫苗株，仅frr_SspH1_rbdA菌株轻微生长减弱，其余菌株适应性无异常。

2. 仅肌注重组抗原只能诱导Th2偏向全身IgG，几乎无肠道IgA；口服YS1646载体可特异性激活肠道黏膜免疫，产生抗原特异性IgA并偏向Th1型IgG2c应答。

3. 肌注联合口服多模式免疫可同时诱导高亲和力全身IgG与肠道黏膜IgA，兼顾Th1/Th2双重免疫应答，免疫效果优于单一给药方式。

4. 常规免疫剂量下，靶向TcdA的单纯口服或多模式免疫可完全保护小鼠免受艰难梭菌致死攻毒；提高抗原剂量后，单独口服疫苗即可实现100%生存。

5. 传统仅肌注疫苗因缺失肠道黏膜IgA，难以抵御肠道定植艰难梭菌，是三期临床试验失败重要原因；基于YS1646的黏膜疫苗弥补该短板，具备临床开发价值。

6. 减毒沙门氏菌YS1646有成熟人体安全数据，本多模式黏膜疫苗候选物具备推进I期临床试验的条件，后续仍需优化抗原表达与给药方案。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

1. Bioscreen C采用100孔蜂窝板，37℃恒温、每30分钟自动检测OD600，连续24h全自动监测野生YS1646与多株重组菌生长，无需人工值守，消除分段检测人为误差，完整记录延滞期、对数期、稳定期全生长动态。

2. 同步平行检测全部基因改造菌株，标准化培养体系实现横向公平对比，精准量化frr_SspH1_rbdA菌株生长速率下降至野生株80%，其余菌株无显著生长缺陷，快速筛选适合动物实验的菌株。

3. 生长曲线数据作为体外安全性初筛指标，提前排除因抗原插入导致生长严重受损的菌株，避免体内免疫实验因菌株活力不足造成结果偏差，节约动物实验成本。

4. 定量生长参数为后续口服免疫给药剂量提供依据，根据菌株体外增殖能力统一各组口服菌液CFU浓度，保证免疫变量单一，实验结果可靠。

5. 24h连续生长数据可直观证明染色体整合抗原不会大幅破坏沙门氏菌基础生理功能，从体外层面佐证该疫苗载体遗传稳定性与生物安全性，为临床转化提供体外数据支撑。

6. 配套软件自动计算生长速率，无需手动绘图计算，标准化数据便于统计对比，形成菌株分子改造—体外适应性评价—体内免疫实验完整证据链。