Analysis of the hypovirulent Klebsiella pneumoniae with the NDM-5 gene on IncN plasmids
携带IncN型质粒、表达NDM-5基因低毒力肺炎克雷伯菌的特征分析
来源：Microbiology Spectrum, January 2024, Volume 12, Issue 1
, DOI:10.1128/spectrum.03443-23
《微生物学谱》，2024年1月，第12卷第1期，DOI:10.1128/spectrum.03443-23
摘要
产NDM-5金属碳青霉烯酶的多重耐药肺炎克雷伯菌临床传播风险极高，目前NDM-5多位于IncX3质粒，NDM-5定位于IncN型质粒的菌株研究十分匮乏。本研究从肝脓肿患者分离得到ST147分型菌株KP4089，通过全基因组测序、药敏检测、接合实验、毒力表型、质粒适应性成本、质粒稳定性等多维度解析该菌株特征。测序证实blaNDM-5位于92.284 kb罕见IncN质粒；该菌株携带25种耐药基因、22种毒力基因，对碳青霉烯类、头孢他啶阿维巴坦、大环内酯类耐药，对氨基糖苷类、粘菌素、替加环素敏感；血清杀伤实验、生物膜形成、大蜡螟感染模型、拉丝试验共同证实该菌为低毒力菌株；接合实验证明IncN质粒可将NDM-5转移至大肠杆菌EC600；利用Bioscreen C仪器测定生长曲线、体外共培养竞争实验证实该IncN质粒无宿主适应性代价，且质粒可稳定传代超10代。研究提示临床需加强此类低毒力多重耐药克雷伯菌监测，防控IncN型NDM-5质粒跨菌种传播。
关键词
肺炎克雷伯菌；NDM-5；IncN质粒；低毒力；多重耐药；质粒接合；适应性成本；大蜡螟模型；全基因组测序；质粒稳定性
研究目的
1. 解析临床肝脓肿分离株KP4089基因组特征，明确blaNDM-5所在质粒分型、耐药与毒基因组成。
2. 测定菌株全套抗菌药物敏感性，明确其耐药谱与敏感药物。
3. 验证IncN质粒的接合转移能力，评估NDM-5耐药基因水平传播潜力。
4. 从血清抗性、生物膜、大蜡螟体内感染、拉丝试验多维度判定菌株毒力强弱。
5. 借助生长曲线、体外菌群竞争、连续传代实验评估IncN质粒带给宿主的适应性成本与质粒遗传稳定性。
6. 对比全球IncN质粒同源菌株进化关系，阐释该罕见耐药质粒的流行风险。
研究思路
1. 菌株分离鉴定：三级医院肝脓肿患者标本分离KP4089，VITEK MS质谱完成菌种鉴定。
2. 药敏检测：纸片扩散法测定全套抗菌药MIC，参照EUCAST判读标准，设置标准质控菌株。
3. 质粒分型与接合实验：S1-PFGE+Southern杂交定位NDM-5质粒；以EC600为受体菌做接合实验，筛选接合子并PCR验证耐药基因转移。
4. 全基因组测序与比较基因组：PacBio+HiSeq联合测序，PlasmidFinder、VirulenceFinder注释质粒、耐药、毒力基因；MEGE构建全球同源IncN质粒菌株进化树。
5. 毒力表型检测：人血清存活实验、结晶紫生物膜定量、大蜡螟幼虫感染生存试验、拉丝试验综合评价毒力。
6. 适应性与稳定性检测：Bioscreen C全自动分析仪连续监测菌株生长曲线；接合子与野生菌体外共培养计算相对适应性；21天连续传代检测质粒留存率。
7. 数据统计：GraphPad Prism 8完成生存、生长、药敏数据统计学分析。
研究亮点
1. 首次系统报道携带IncN型blaNDM-5的ST147低毒力肺炎克雷伯菌，填补NDM-5非IncX3质粒菌株研究空白。
2. 多表型联合证明肝脓肿来源菌株KP4089属于低毒力型，打破仅高毒力克雷伯菌致肝脓肿的固有认知。
3. 证实该IncN质粒无宿主适应性负担，菌株携带质粒生长能力无显著下降，且质粒可稳定传代，极大提升院内持续传播风险。
4. 体外接合实验证明IncN质粒可高效将NDM-5转移至大肠杆菌，存在跨菌种多重耐药扩散隐患。
5. 完整多维度实验链条：基因组-药敏-接合-毒力-适应性-进化分析，全面评估该新型耐药克隆临床威胁。
6. 进化树比对发现该IncN质粒与多国分离株高度同源，提示该可移动元件具备全球传播潜能。
可延伸的方向
1. 开展大规模临床菌株筛查，统计国内IncN型NDM-5质粒流行率，建立监测预警方案。
2. 小鼠全身感染模型验证KP4089体内致病力，对比高低毒力CRKP脏器定植差异。
3. 探究IncN质粒上IS插入元件调控NDM-5表达的分子机制，解析质粒稳定遗传机理。
4. 筛选可抑制IncN质粒接合转移的小分子抑制剂，阻断耐药基因水平传播。
5. 联合替加环素/粘菌素开展体外联合药敏，寻找该类感染最优给药组合。
6. 转录组对比携带/缺失IncN质粒菌株基因表达，挖掘质粒调控宿主代谢通路。
测量的数据及研究意义
1. 各抗菌药物MIC及耐药判定结果，来自表1
研究意义：明确KP4089广谱碳青霉烯耐药特征，粘菌素、替加环素为有效治疗备选药物，为临床用药提供依据。
2. S1-PFGE与Southern杂交质粒电泳图谱，来自图2
研究意义：直观证实NDM-5定位于92.284 kb IncN质粒，菌株同时携带ColE型OXA-181质粒，多重移动元件叠加增加耐药传播概率。
3. 全球IncN质粒序列同源比对数据，来自表2、图4
研究意义：该IncN质粒与欧美、亚洲多国菌株同源性88%~99%，证明该质粒具备跨地域、跨菌种传播潜力。
4. 血清存活率、生物膜OD值、大蜡螟生存曲线、拉丝试验结果，来自图1
研究意义：KP4089血清杀伤存活率极低、生物膜形成弱、大蜡螟致死率低、拉丝阴性，多重证据证实其为低毒力菌株，拓展肝脓肿致病菌株认知。
5. Bioscreen C测定各组菌株生长曲线，来自图3A
研究意义：接合子EC600生长速度与原始受体菌无明显差异，证明IncN质粒不产生适应性代价，细菌携带耐药质粒无生存劣势，易长期定植扩散。
6. 质粒连续传代稳定性计数数据，来自图3B
研究意义：无抗生素压力下质粒稳定留存超10代，院内环境极易持续留存耐药菌株。
7. 体外共培养相对适应性指数，来自图3C
研究意义：适应性指数＞1，携带IncN质粒菌株竞争能力更强，在菌群中占生存优势。
8. 菌株基因组、质粒基因圈图，来自图5
研究意义：清晰定位染色体、4个质粒上全部耐药、毒力、移动元件，解析多重耐药与毒力基因分布格局。
结论
1. 从肝脓肿患者分离ST147型肺炎克雷伯菌KP4089，其blaNDM-5基因定位于罕见92.284 kb IncN质粒，区别于国内主流IncX3-NDM-5菌株。
2. KP4089携带25种耐药基因、22种毒力基因，对碳青霉烯、头孢他啶阿维巴坦等多种药物耐药，粘菌素、替加环素可用于临床治疗。
3. 多重毒力表型检测证明KP4089属于低毒力肺炎克雷伯菌，说明肝脓肿感染并非仅由高毒力克隆引发。
4. IncN质粒可通过接合将NDM-5转移至大肠杆菌，存在跨菌种多重耐药传播风险；该质粒不会造成宿主适应性降低，且传代稳定性极强。
5. 该IncN质粒与全球多国分离株高度同源，具有广泛流行潜能，临床微生物实验室需加强监测。
6. 低毒力多重耐药克雷伯菌隐蔽性强、易被忽视，需完善院内细菌筛查与感染防控策略。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 本研究采用Bioscreen C-Pro全自动生长分析仪高通量同步检测KP4089、接合子、EC600对照菌株连续OD值，全程自动化监测生长全过程，避免人工间断取样带来操作误差。
2. 仪器可长时间恒温振荡培养，完整记录延滞期、对数期、稳定期动态变化，精准对比有无IncN质粒菌株生长速率、最大菌密度差异。
3. 标准化统一培养体系，各组培养基、接种浓度、孵育条件完全一致，横向公平对比质粒对宿主生长的影响，直观得出该质粒无适应性代价的核心结论。
4. 生长曲线数据与体外菌群竞争、质粒传代稳定性实验形成完整证据链：质粒不抑制生长→菌株竞争优势强→无药环境稳定传代，完整解释该耐药克隆易扩散的分子基础。
5. 仪器批量平行设置生物学重复，数据重复性好、统计学可信度高，为质粒适应性相关结论提供定量生长动力学支撑。
6. 生长检测方案可标准化用于其他耐药质粒适应性评估，快速判断各类可移动元件是否给宿主带来生存负担。