Inhibition of planktonic growth and biofilm formation of Staphylococcus aureus by entrectinib through disrupting the cell membrane
恩曲替尼通过破坏细胞膜抑制金黄色葡萄球菌浮游生长与生物膜形成
来源：Frontiers in Microbiology, Volume 13, Article ID 1106319, 2023, DOI:10.3389/fmicb.2022.1106319
《微生物前沿》，第13卷，文章编号1106319，2023年，DOI:10.3389/fmicb.2022.1106319
摘要
金黄色葡萄球菌感染临床危害巨大，多重耐药菌株（MRSA等）、生物膜形成加剧治疗难度。本研究基于药物重定位策略，首次证实抗癌药物恩曲替尼具备抗金黄色葡萄球菌活性。体外实验表明恩曲替尼可抑制甲氧敏感、耐药金葡菌浮游生长，亚抑菌浓度即可显著阻断生物膜生成；细胞毒性、溶血实验证明有效抑菌浓度下恩曲替尼对哺乳动物细胞、红细胞无明显毒性。小鼠MRSA创面感染模型显示恩曲替尼可显著降低感染组织细菌载量，体内抗菌效果与万古霉素相当。无标记定量蛋白组显示恩曲替尼处理后金葡菌核糖体、氧化应激相关蛋白表达大幅改变，胞内活性氧（ROS）显著积累。体外持续诱导获得恩曲替尼耐药菌株，全基因组测序发现该菌株存在3个氨基酸突变，2个位于II型NADH醌氧化还原酶（NDH-2）编码基因，1个位于GTP焦磷酸激酶基因；分子对接证实恩曲替尼可与NDH-2稳定结合。膜电位荧光探针、透射电镜结果证明恩曲替尼通过破坏金葡菌细胞膜完整性发挥杀菌作用。本研究证实恩曲替尼靶向细胞膜发挥抑菌、抗生物膜双重作用，为耐药金葡菌感染提供全新候选治疗药物。
关键词
恩曲替尼；金黄色葡萄球菌；甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌；生物膜；抗菌活性；细胞膜损伤；氧化应激；蛋白组学；药物重定位；全基因组测序
研究目的
1. 验证抗癌药物恩曲替尼对甲氧西林敏感（MSSA）、耐药（MRSA）金黄色葡萄球菌的体外抑菌、抗生物膜能力。
2. 评价恩曲替尼体外细胞毒性、溶血安全性，借助小鼠创面感染模型验证体内抗感染疗效。
3. 通过蛋白组解析恩曲替尼处理后金葡菌全局蛋白表达变化，明确菌体应激响应通路。
4. 诱导获得恩曲替尼耐药菌株，通过全基因组测序筛选耐药突变靶点，结合分子对接预测药物作用蛋白。
5. 从细胞膜电位、超微结构、胞内ROS三个维度阐明恩曲替尼破坏金葡菌细胞膜的杀菌机制。
6. 为抗耐药金葡菌新型药物重定位、膜靶向抗菌制剂开发提供实验依据。
研究思路
1. 体外抑菌初筛：微量肉汤稀释法测定恩曲替尼对多种金葡菌、粪肠球菌MIC/MFC；采用芬兰Bioscreen C仪器绘制24小时生长曲线，计时杀菌实验定量杀菌动力学。
2. 生物膜评价：结晶紫染色定量生物膜总量，激光共聚焦显微镜观察生物膜三维结构与活菌/死菌分布。
3. 安全性体内外评价：CCK-8检测293T细胞活力、溶血实验评价红细胞毒性；构建小鼠MRSA皮肤创面感染模型，给药后检测组织细菌载量。
4. 组学分析：无标记定量蛋白组对比药物处理与对照组蛋白差异，GO、PPI分析差异蛋白功能通路。
5. 耐药突变筛选：60天梯度药物压力诱导耐药菌株，全基因组测序对比亲本与耐药株基因差异；分子对接模拟药物与NDH-2结合模式。
6. 机制验证：DiBAC4(3)检测细胞膜去极化、DCFH-DA检测胞内ROS、透射电镜观察细胞膜破损超微结构，完整阐释膜损伤杀菌通路。
研究亮点
1. 创新药物重定位思路，首次报道FDA获批抗肿瘤药物恩曲替尼具备广谱抗耐药金葡菌活性，拓展老药临床应用场景。
2. 体外亚抑菌浓度即可强效抑制生物膜，同时体内动物模型证实其抗感染效果与一线万古霉素相近，兼具体外、体内双重药效证据。
3. 多技术联合阐明完整杀菌通路：破坏细胞膜→膜去极化→胞内ROS大量蓄积→菌体死亡；蛋白组揭示核糖体合成、氧化应激通路扰动。
4. 定位恩曲替尼潜在作用靶点NDH-2（金葡菌特有呼吸蛋白，人体无同源蛋白），为高选择性抗菌药物开发提供全新靶点。
5. 明确耐药相关基因突变位点，解释金葡菌对恩曲替尼耐受的遗传机制，为临床合理用药、避免耐药产生提供参考。
6. 安全性数据优异，抑菌有效浓度无溶血、低哺乳动物细胞毒性，具备局部外用、全身给药开发潜力。
可延伸的方向
1. 开展恩曲替尼与万古霉素、达托霉素等临床抗生素联合抑菌实验，评估协同/相加效应。
2. 优化恩曲替尼衍生物结构，提升抗菌活性、降低抗肿瘤相关副作用，开发专用抗菌先导化合物。
3. 开展长期动物毒理、药代动力学实验，明确体内给药剂量、代谢途径与组织分布。
4. 深入验证NDH-2为恩曲替尼直接作用靶点，体外蛋白结合、酶活实验验证药物抑制蛋白功能。
5. 探究恩曲替尼对植入器械相关生物膜感染的清除效果，开发医用材料抗菌涂层。
6. 检测恩曲替尼对其他多重耐药革兰阳性菌（粪肠球菌、耐万古肠球菌）的抑菌广谱性。
7. 转录组联合蛋白组多组学联合解析恩曲替尼调控金葡菌代谢的完整分子网络。
测量的数据及研究意义
1. MIC、MFC数值、Bioscreen动态生长曲线、计时杀菌CFU计数，数据来源：表1、图1；研究意义：定量明确恩曲替尼对MRSA、MSSA均有抑菌杀菌活性，25μM即可实现强效抑制，4倍MIC浓度杀菌效果优于万古霉素，证明其抗耐药菌潜力。
2. 结晶紫生物膜吸光度、激光共聚焦生物膜厚度/活菌荧光定量，数据来源：图2A、2B、2C；研究意义：证实亚抑菌剂量就能显著抑制金葡菌生物膜形成，解决临床生物膜相关感染抗生素难渗透难题。
3. 溶血吸光度、293T细胞CCK8活力值、小鼠创面组织CFU，数据来源：图2D、2E、2F；研究意义：证明有效抑菌浓度无溶血、低细胞毒性，体内可显著降低感染菌载，安全性与体内药效双重支撑后续制剂开发。
4. 蛋白组差异蛋白火山图、GO富集、蛋白互作网络，数据来源：图3；研究意义：从分子层面揭示药物扰动核糖体合成、激活氧化应激通路，解释菌体生长受阻、氧化损伤死亡内在机制。
5. 耐药株突变基因、NDH-2分子对接结合能与相互作用位点，数据来源：图2G；研究意义：锁定NDH-2为药物潜在作用靶标，阐明耐药突变发生位点，为靶点药物设计、临床耐药防控提供依据。
6. 细胞膜去极化荧光强度、胞内ROS荧光定量、透射电镜菌体超微结构，数据来源：图4A、4B、4C；研究意义：直观证明恩曲替尼破坏细胞膜屏障，引发膜电位紊乱与ROS蓄积，明确细胞膜损伤是核心杀菌机制。
结论
1. 抗肿瘤药物恩曲替尼对甲氧西林敏感、耐药金黄色葡萄球菌均具备剂量依赖性抑菌与杀菌作用，亚抑菌浓度显著抑制生物膜生成。
2. 恩曲替尼体外无溶血毒性、对哺乳动物细胞毒性极低，小鼠MRSA创面感染模型中体内抗菌活性与万古霉素相当。
3. 恩曲替尼处理会改变金葡菌核糖体、氧化应激相关蛋白表达，诱导大量胞内活性氧累积，触发氧化损伤。
4. 持续药物压力可诱导金葡菌产生耐药，耐药株NDH-2、GTP焦磷酸激酶基因出现关键突变；分子对接显示恩曲替尼可与NDH-2蛋白稳定结合。
5. 恩曲替尼通过破坏金葡菌细胞膜完整性、引发膜去极化，最终造成菌体内容物泄漏、细胞死亡，膜损伤是其核心抗菌机制。
6. 恩曲替尼可作为药物重定位候选分子，用于临床多重耐药金葡菌、生物膜相关感染的新型治疗方案开发。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 实现24小时每小时连续自动采集OD600数值，全程动态记录金葡菌延迟期、对数期、稳定期完整增殖曲线，区别于单一终点MIC静态数据，精准区分抑菌、杀菌两种药效模式。
2. 标准化37℃恒温振荡密闭培养环境，消除人工间断取样带来污染、温度波动、操作误差，保证不同药物浓度、不同菌株的生长数据平行可比，可靠量化浓度梯度带来的生长抑制差异。
3. 一次性批量同步检测多株金葡菌（MRSA/MSSA）、多浓度梯度与空白对照，高通量快速筛选最优抑菌作用浓度，大幅缩短药效初筛实验周期。
4. 动态生长曲线与计时杀菌平板CFU计数形成表型交叉验证，证明恩曲替尼不只是延缓增殖，随作用时间延长可彻底杀灭浮游菌体。
5. 微量96孔培养体系大幅节约珍贵恩曲替尼药物原料，降低多梯度浓度筛选的实验耗材与试剂成本。
6. 直观可视化不同时间段的生长抑制强弱，能够清晰对比药物短期、长效抑菌效果，为后续体外联合给药、体内给药间隔设计提供动态时效数据支撑。