Streptococcus strain D19T as a probiotic candidate to modulate oral health
D19链球菌菌株作为调节口腔健康的益生菌候选菌株
来源：BMC Microbiology, 2023, Volume 23, Article number 339, DOI:10.1186/s12866-023-03066-7
《BMC微生物学》，2023年，第23卷，文章编号339，DOI:10.1186/s12866-023-03066-7
摘要
口腔微生态失衡易诱发咽炎、龋齿、牙龈炎等多种口腔疾病，来源于健康人体的共生链球菌具备开发口腔益生菌的潜力。本研究从健康儿童口咽分离得到新型链球菌D19T，通过多重体外实验系统评价其益生菌潜力。菌株分类鉴定确认其为新型沈阳链球菌；耐受实验结果显示D19T可适应pH2–5酸性环境、0.5%胆汁、200μg/mL溶菌酶及0.8mM过氧化氢等口咽恶劣条件；牛津杯抑菌实验证实该菌对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等8种常见致病菌均有拮抗作用；细胞毒性实验表明不同感染复数下D19T对人支气管上皮16-HBE细胞无损伤；药敏检测显示菌株仅对卡那霉素、诺氟沙星耐药，其余临床常用抗生素均敏感；粘附实验证明D19T对上皮细胞粘附率47%，显著高于金黄色葡萄球菌；竞争、排斥、置换三类粘附抑制实验均证实D19T可显著降低金黄色葡萄球菌上皮粘附能力。综上，D19T具备优良益生菌体外特征，可作为调节口腔、上呼吸道微生态的益生菌开发原料。
关键词
链球菌；益生菌；口腔微生态；粘附能力；抑菌活性；上皮细胞；耐胁迫；金黄色葡萄球菌；抗生素敏感性
研究目的
1. 分离并分子鉴定健康儿童口咽来源链球菌D19T菌株，明确其物种分类地位。
2. 检测菌株耐受酸性、胆汁、溶菌酶、氧化应激等口咽部胁迫环境的能力。
3. 评价D19T对多种临床致病细菌的体外抑菌广谱活性。
4. 测定菌株抗生素敏感性，评估其临床应用安全风险。
5. 验证D19T对人支气管上皮细胞的细胞毒性，确认生物安全性。
6. 定量检测菌株上皮粘附能力，并从竞争、排斥、置换三个维度分析其抑制金黄色葡萄球菌粘附的效果。
7. 综合体外表型数据，判断D19T作为口腔/上呼吸道益生菌的开发潜力。
研究思路
1. 菌株分离与鉴定：采集健康儿童口咽拭子，划线分离α溶血链球菌，16S rRNA测序开展系统发育比对，确定为新型沈阳链球菌D19T。
2. 胁迫耐受实验：设置梯度pH、胆汁、溶菌酶、过氧化氢培养体系，采用芬兰Bioscreen仪器连续24h测定OD生长曲线，评估菌株存活增殖能力。
3. 抑菌实验：牛津杯法检测D19T发酵上清对8种标准致病菌的抑制圈直径，划分抑菌强弱等级。
4. 药敏实验：纸片扩散法检测13种常用抗生素敏感性，判定敏感/中介/耐药表型。
5. 细胞毒性实验：设置0.2、2、20三种感染复数，D19T与16-HBE细胞共培养，MTT法测定细胞存活率。
6. 粘附及拮抗粘附实验：FITC荧光标记细菌，分竞争、排斥、置换三组共培养，荧光定量计算细菌粘附率与抑制效率。
7. 数据统计：单因素方差分析结合邓肯多重比较，P<0.05判定差异显著。
研究亮点
1. 分离得到新型人源沈阳链球菌D19T，人体来源菌株安全性优于外源益生菌菌株。
2. 该菌耐受口腔全部典型胁迫条件（强酸、胆汁、溶菌、氧化应激），可在口咽部稳定定植存活。
3. 具备广谱抑菌效果，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌抑制作用最强，可同时抑制多种口腔、呼吸道致病菌。
4. 仅两种抗生素耐药，绝大多数临床抗菌药物敏感，不存在耐药基因水平传播安全隐患。
5. 上皮粘附能力显著强于致病菌，三重机制（竞争、排斥、置换）抑制金黄色葡萄球菌定植，可修复口腔黏膜微生态屏障。
6. 整套体外益生菌评价体系完整，生长动力学定量数据支撑菌株环境适应性结论。
可延伸的方向
1. 开展D19T全基因组测序，挖掘粘附蛋白、抑菌素、耐胁迫相关功能基因。
2. 构建小鼠口腔/呼吸道感染模型，体内验证菌株抑菌、调节菌群、抗炎功效。
3. 优化菌株发酵、冻干制剂工艺，开发口腔含片、漱口水等益生菌产品。
4. 探究D19T产生抑菌代谢产物（有机酸、细菌素）的分子结构与作用靶点。
5. 开展人体临床试验，评估长期服用对龋齿、咽炎人群口腔菌群的调节效果。
6. 探究D19T与其他益生菌复配协同作用，提升微生态调控能力。
测量的数据及研究意义
1. 不同胁迫条件下菌株24h生长OD曲线，来自图1
研究意义：pH2–5、0.5%胆汁、各浓度溶菌酶/过氧化氢中菌株均可稳定增殖，仅1%胆汁下生长受明显抑制，证明D19T可适应口腔生理恶劣环境，具备体内定植基础。
2. 8种致病菌抑菌圈直径分级数据，来自表1
研究意义：D19T对金葡菌、铜绿假单胞菌抑菌圈≥20mm（强抑制），其余致病菌中等抑制，说明菌株广谱拮抗致病菌，可改善致病菌过度增殖导致的口腔病变。
3. 13种抗生素药敏结果，来自表2
研究意义：仅卡那、诺氟沙星耐药，其余全部敏感，菌株耐药风险低，临床联用抗生素时益生菌不易失活，应用安全性高。
4. 不同MOI下16-HBE细胞存活率，来自图2
研究意义：各感染复数下细胞活力无显著下降，高MOI下无细胞毒性，证明D19T对呼吸道上皮无损伤，人体应用安全。
5. D19T与金葡菌上皮粘附率对比，来自图3
研究意义：D19T粘附率约47%，远高于金葡菌，菌株可优先占据上皮结合位点，从源头阻断致病菌粘附定植。
6. 竞争、排斥、置换三组粘附抑制率，来自表3
研究意义：竞争抑制率62.67%、置换抑制率52.24%，排斥同样显著降低致病菌粘附，三重作用协同保护黏膜屏障，恢复菌群平衡。
结论
1. 本研究从健康儿童口咽分离得到新型沈阳链球菌D19T，16S rRNA序列证实其为新型草绿色链球菌物种。
2. D19T可耐受口腔酸性、胆汁、溶菌酶、氧化应激等多种胁迫，能在口咽部稳定存活。
3. 菌株对8种口腔、呼吸道致病菌具备广谱抑菌活性，对金黄色葡萄球菌抑制效果最优。
4. D19T仅两种抗生素耐药，对上皮细胞无细胞毒性，生物安全性能良好。
5. D19T上皮粘附能力显著优于致病菌，可通过竞争、排斥、置换三种途径大幅抑制金黄色葡萄球菌粘附上皮细胞。
6. D19T拥有完整优良体外益生菌特征，是开发口腔、上呼吸道微生态调节益生菌制剂的优质候选菌株。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 采用Bioscreen全自动生长分析仪批量同步检测多梯度胁迫培养组，全程24h每30分钟自动读取OD600，无需人工间断取样，消除人为操作误差。
2. 完整记录菌株延滞期、对数期、稳定期动态变化，精准量化不同pH、胆汁、氧化剂对生长速率、最终菌量的影响，直观区分0.5%与1%胆汁耐受差异。
3. 所有组别培养温度、振荡、培养基条件完全标准化，实现多胁迫条件横向公平对比，定量评估菌株环境适应能力。
4. 生长动力学连续数据替代单一终点OD值，可观察短期适应与长期稳定增殖两种表型，完整证明菌株能长期在口腔胁迫环境存活。
5. 平行生物学重复自动采集数据，统计学可信度更高，为菌株定植潜力结论提供定量生长证据。
6. 标准化高通量胁迫检测方案，可作为后续其他口腔益生菌菌株体外适应性筛选通用方法。