Bacillus velezensis spores alleviate Salmonella Typhimurium infection by improving intestinal barrier integrity and regulating gut microbiota
贝莱斯芽孢杆菌孢子通过改善肠道屏障完整性并调控肠道菌群缓解鼠伤寒沙门氏菌感染
来源：eLife, Volume 13, Article ID RP93423, 2024, DOI:10.7554/eLife.93423
《eLife》第13卷，文章编号RP93423，2024年，DOI：10.7554/eLife.93423
摘要
鼠伤寒沙门氏菌是重要食源性人畜共患病原，抗生素滥用易诱发耐药、破坏肠道菌群，亟需益生菌替代防控方案。本研究从湖北散养黑仔猪粪便分离贝莱斯芽孢杆菌HBXN2020，体外实验证实该菌株孢子耐酸碱、胆汁、高温，且对多种致病菌具备广谱抑菌活性，全基因组测序确认无耐药、毒力基因，小鼠灌胃不同剂量菌株无肝肾、脏器损伤，生物安全良好。分别开展预防、治疗两类小鼠沙门氏菌感染模型实验，结果显示HBXN2020可显著降低小鼠体重丢失、疾病活动指数DAI，减轻结肠组织病理损伤；分子检测表明菌株上调紧密连接蛋白Tjp1、Ocln、Cldn1、黏蛋白Muc2，修复肠道屏障，同时下调促炎因子Tnfa、Il1b、Il6，提升抑炎因子Il10；16S测序证实该芽孢杆菌提升肠道菌群丰富度，增加乳杆菌、阿克曼菌等有益菌丰度，降低沙门氏菌、肠球菌等致病菌丰度。相比环丙沙星，HBXN2020不会大幅消耗肠道有益菌群，可作为预防、治疗沙门氏菌肠炎的益生菌候选。
关键词
贝莱斯芽孢杆菌；鼠伤寒沙门氏菌；益生菌；肠道屏障；肠道菌群；炎症因子；生物安全；16S rRNA测序；动物感染模型
研究目的
1 分离、鉴定贝莱斯芽孢杆菌HBXN2020，完成体外环境耐受、广谱抑菌、基因组生物安全评价。
2 采用芬兰Bioscreen仪器测定菌株生长曲线，明确基础生长特征。
3 通过安全毒性试验，验证不同剂量HBXN2020对小鼠脏器、血液生化指标无损伤。
4 构建预防、治疗两种沙门氏菌感染小鼠模型，探究菌株缓解肠炎的生理、分子机制。
5 对比益生菌与抗生素对肠道菌群的差异化影响，阐明HBXN2020调控菌群稳态的优势。
研究思路
1 菌株分离筛选：多地畜禽粪便富集分离芽孢，平板抑菌实验筛选高抑菌活性菌株，16S与全基因组鉴定为贝莱斯芽孢杆菌HBXN2020。
2 体外特性检测：Bioscreen全自动检测仪测定生长曲线；设置温度、pH、胆汁、模拟胃肠液梯度测定孢子与营养体细胞存活率；纸片扩散法检测18株病原菌抑菌谱。
3 基因组解析：PacBio+Illumina联合测序，注释全部编码基因、次级代谢基因簇，ANI与全基因组进化树确定分类，筛查毒力、耐药元件。
4 体内安全性评价：低/中/高剂量芽孢灌胃小鼠15天，记录体重，采血做血常规、肝肾功能生化，心肝肾脾结肠组织病理切片观察。
5 治疗模型：沙门氏菌攻毒后分时段灌胃芽孢/环丙沙星/生理盐水，每日记录体重、DAI，收集粪便、盲肠结肠定量沙门氏菌载量，结肠qPCR检测屏障、炎症基因，HE染色病理观察。
6 预防模型：提前一周饲喂芽孢再攻毒沙门氏菌，重复感染、菌群、分子指标检测。
7 肠道微生物16S测序：各组结肠菌群多样性、门属水平物种差异，LEfSe筛选差异菌。
8 整合体外、基因组、体内病理、分子、组学数据，完整阐述HBXN2020抗沙门氏菌感染机制。
研究亮点
1 分离得到高抗逆、广谱抑菌贝莱斯芽孢杆菌HBXN2020，基因组无耐药与毒力基因，动物多剂量试验证实完全安全。
2 首次同时建立预防、治疗两套沙门氏菌小鼠模型，证实芽孢杆菌两种给药模式均可有效缓解沙门氏菌诱导肠道炎症。
3 完整阐明三重保护机制：修复肠道紧密连接屏障、调控促/抑炎因子平衡、重塑肠道有益菌群结构。
4 对比抗生素环丙沙星，证明益生菌不会破坏乳杆菌、阿克曼菌等核心有益菌，规避抗生素致菌群失调缺陷。
5 采用Bioscreen高通量生长定量快速完成菌株体外抗逆与增殖特性筛选，为益生菌体外初筛建立标准化流程。
可延伸的方向
1 分离HBXN2020抑菌代谢产物，纯化鉴定活性脂肽/聚酮类抑菌物质，开发天然抗菌添加剂。
2 田间仔猪饲喂试验，验证菌株对畜禽沙门氏菌腹泻实际防控效果。
3 改造菌株启动子，强化黏蛋白、抗炎相关代谢产物分泌，提升体内保护效率。
4 开展菌株与噬菌体、植物提取物复配，构建复合抗沙门氏菌制剂。
5 转录组测序解析HBXN2020作用于肠道上皮细胞的完整信号通路。
测量的数据及研究意义
1 Bioscreen仪器连续测定HBXN2020生长OD曲线（图1A），明确菌株2h进入对数期、10h达稳定期生长规律，确定后续所有体外培养标准化孵育时长，直观反映菌株增殖速率，证明其生长活力适合发酵规模化制备芽孢制剂。
2 温度、pH、胆汁、模拟胃肠液孢子/营养体细胞存活率数据（图1B-F），证实芽孢具备极强加工与消化道耐受能力，适合口服益生菌剂型开发，营养体细胞抗逆性弱，后续制剂优先选用孢子剂型。
3 琼脂扩散抑菌圈数据，HBXN2020对大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌等18株致病菌均有抑制效果，证明该菌株广谱抗菌优势，适用畜禽、食品多种致病菌防控场景。
4 菌株完整基因组图谱、次级代谢基因簇注释（图2），基因组不含耐药、毒力、溶原相关基因，从遗传层面证明菌株生物安全，注释多个抑菌脂肽合成基因，解释菌株广谱抑菌分子基础。
5 小鼠体重、血常规、肝肾生化、脏器病理安全检测数据（图4），低、中、高剂量饲喂小鼠体重无下降，血液、肝肾功能指标均在正常范围，心肝脾肺肾无病理损伤，确认菌株口服无全身毒性，动物应用安全。
6 治疗模型小鼠体重、DAI、结肠长度、脏器沙门氏菌载量（图5），HBXN2020处理组体重丢失、疾病评分显著低于感染对照组，结肠萎缩程度减轻，盲肠、结肠沙门氏菌载量大幅下降，证明菌株可体内清除定植致病菌。
7 结肠紧密连接、炎症因子qPCR定量（图6、图9），益生菌组Tjp1/Ocln/Cldn/Muc2屏障基因显著上调，肠道机械屏障修复，Tnfa/Il1b/Il6促炎基因下调、抑炎Il10升高，平衡肠道炎症反应。
8 结肠组织HE病理切片数据（图6A、图9A），沙门氏菌组肠隐泡破损、大量炎症细胞浸润，HBXN2020处理组黏膜完整，炎症浸润显著减轻，直观缓解肠道损伤。
9 肠道16S菌群Alpha/Beta多样性、物种丰度、LEfSe差异分析（图7、图10），沙门氏菌感染降低菌群丰富度，芽孢杆菌处理恢复菌群多样性，乳杆菌、阿克曼菌等有益菌丰度上升，致病型肠杆菌科丰度下降，环丙沙星同步削减有益菌，益生菌无此副作用，菌群调控更安全。
结论
1 从黑猪粪便分离贝莱斯芽孢杆菌HBXN2020，孢子耐受高温、强酸、胆汁及模拟胃肠液，体外广谱抑制多种畜禽、食源致病菌，基因组无耐药、毒力基因，多剂量小鼠饲喂无脏器与血液毒性，生物安全性优良。
2 无论提前预防给药还是感染后治疗给药，HBXN2020芽孢均可显著缓解鼠伤寒沙门氏菌诱导小鼠肠炎，降低体重丢失、肠道病变指数与脏器致病菌载量。
3 HBXN2020通过三重途径发挥肠道保护作用：上调紧密连接与黏蛋白基因修复上皮屏障；抑制促炎因子、提升抑炎因子减轻黏膜炎症；重塑肠道菌群，富集乳杆菌、阿克曼菌等有益菌群。
4 相较于抗生素环丙沙星，该芽孢杆菌不会大量消耗肠道有益共生菌，可规避抗生素引发菌群紊乱、继发感染缺陷。
5 HBXN2020具备开发畜禽口服益生菌、食品生物保鲜制剂的潜力，可作为抗生素替代物防控沙门氏菌感染。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用芬兰Bioscreen全自动微生物多孔检测仪，96孔微孔同步设置多重复培养体系，全程每小时自动读取OD600数值，连续监测24h生长，无需人工多次取样稀释测浊，大幅减少人为操作带来的读数偏差与实验人力消耗。
2 仪器完整记录延滞、对数、稳定全生长阶段动态变化，精准定位菌株各生长节点，为体外抑菌、抗逆、共培养实验统一标准培养时长，单点终点OD无法完整反映增殖动力学特征。
3 全部LB培养基、接种初始菌浓度、37℃恒温振荡条件完全标准化，各组数据平行性、统计学可比性强，快速判定菌株生长性能优劣。
4 Bioscreen生长曲线作为菌株基础生理前置证据，和体外抗逆抑菌、基因组安全、体内动物病理、菌群组学多层实验形成完整证据链，让益生菌功能结论更严谨可靠。
5 高通量多孔并行检测模式一次性完成多批次生长重复测定，省去多批次摇瓶培养，大幅缩短菌株体外特性初筛周期，提升整套菌种评价实验效率。