Extracellular vesicles of Candida albicans show dual effects on Enterococcus faecalis: A laboratory-based investigation
白色念珠菌胞外囊泡对粪肠球菌生长与毒力存在双重作用：一项体外实验室研究
来源：International Endodontic Journal, Volume 58, Pages 613–626, 2025, DOI:10.1111/iej.14199
《国际牙体牙髓病杂志》第58卷，页码613-626，2025年，DOI：10.1111/iej.14199
摘要
根管治疗后持续性根尖周炎（PTED）主要致病菌为粪肠球菌，白色念珠菌常与粪肠球菌在根管内共存，二者跨界互作机制尚不明确。本研究分离纯化白色念珠菌胞外囊泡（EVs），设置梯度囊泡浓度处理粪肠球菌，系统评估囊泡对细菌增殖、生物膜、环境耐受、牙本质侵袭、充填材料定植、巨噬细胞毒性的影响。结果显示囊泡存在浓度依赖性双重效应：低浓度0.156 μg/mL促进粪肠球菌生长、生物膜形成、根管侵袭与巨噬细胞损伤；高浓度5 μg/mL显著抑制上述所有毒力相关表型。高浓度EVs降低粪肠球菌耐次氯酸钠、饥饿碱性胁迫能力，降低其在巨噬细胞内存活能力，且EVs自身无巨噬细胞毒性。该研究证实白色念珠菌胞外囊泡是真菌-细菌跨界通讯关键信号分子，高浓度囊泡具备抑制粪肠球菌的应用潜力。
关键词
白色念珠菌；粪肠球菌；胞外囊泡；根管治疗后根尖周炎；生物膜；跨界互作；细菌毒力；牙本质侵袭；巨噬细胞毒性
研究目的
1 分离鉴定白色念珠菌分泌胞外囊泡，明确囊泡粒径、形态、蛋白特征。
2 探究不同浓度白色念珠菌EVs对浮游态粪肠球菌生长的影响，筛选高低效应特征浓度。
3 分析EVs对粪肠球菌生物膜形成、消毒/饥饿碱性环境耐受性的调控作用。
4 评估EVs改变粪肠球菌侵袭牙本质、牙胶尖定植能力的效应。
5 阐明不同浓度EVs调控粪肠球菌介导巨噬细胞损伤、胞内存活的分子表型。
6 评价高浓度EVs作为抑制根管致病菌新型调控介质的应用潜力。
研究思路
1 囊泡制备与鉴定：YNB培养基培养白色念珠菌，超速离心法分离EVs，透射电镜、扫描电镜、纳米颗粒追踪仪NTA观测形态粒径，BCA定量囊泡蛋白。
2 浮游菌生长实验：设置0.039–5 μg/mL EV浓度梯度，芬兰Bioscreen仪器连续24h检测OD生长曲线，分时间点涂布计数CFU，筛选特征浓度0.156、5 μg/mL。
3 生物膜检测：结晶紫定量、扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察EVs处理后粪肠生物膜结构与生物量。
4 胁迫耐受实验：3%次氯酸钠、pH9/11饥饿碱性环境处理生物膜，统计活菌存活率。
5 牙本质、牙胶尖定植模型：离体人牙根牙本质块、牙胶尖共培养粪肠球菌与两种浓度EVs，扫描电镜观察细菌侵袭定植情况。
6 巨噬细胞实验：RAW264.7巨噬细胞共感染粪肠球菌与EVs，LDH检测细胞毒性，分时段胞内外活菌计数，监测胞内细菌存活能力。
7 整合所有体外表型数据，阐释EVs浓度依赖性双重调控规律与根管临床意义。
研究亮点
1 首次证实白色念珠菌胞外囊泡对粪肠球菌存在完全相反的双重调控效应，效应严格依赖囊泡浓度。
2 明确低浓度EVs全面提升粪肠球菌增殖、生物膜、根管侵袭、免疫逃逸等致病表型，解释真菌细菌共感染加重根尖病变机制。
3 高浓度EVs可全方位抑制粪肠球菌毒力，降低其消毒耐受与巨噬细胞内存活能力，且自身无细胞毒性，为根管抑菌提供新思路。
4 同步建立浮游菌、生物膜、离体牙组织、巨噬细胞多层体外模型，完整模拟根管内复杂微环境。
5 利用Bioscreen高通量生长曲线定量，精准区分不同囊泡浓度对细菌增殖细微差异，为后续功能实验锁定标准处理浓度。
可延伸的方向
1 解析白色念珠菌EVs内活性蛋白、脂质组分，筛选调控粪肠球菌的核心信号分子。
2 转录组测序对比高低EVs处理后粪肠球菌基因差异，挖掘毒力调控通路。
3 动物根尖周炎体内模型验证高浓度EVs缓解根尖病变实际效果。
4 研发负载高浓度EVs根管封药制剂，评估临床根管消毒辅助作用。
5 探究其他口腔真菌（光滑念珠菌等）胞外囊泡对多种根管致病菌的调控作用。
测量的数据及研究意义
1 白色念珠菌EV形态、粒径NTA检测数据（图1），电镜证实囊泡为双层膜纳米球状颗粒，粒径集中50–160 nm，符合真菌胞外囊泡典型特征，蛋白定量标准化所有实验组囊泡给药剂量，保证各组实验变量统一。
2 Bioscreen连续生长曲线与分时段CFU计数数据（图2），梯度浓度实验直观区分促进/抑制临界区间，确定0.156、5 μg/mL为两组代表性实验浓度，动态OD时序数据完整呈现24h全周期增殖差异，单点计数无法反映生长全过程变化。
3 生物膜结晶紫、电镜、激光共聚焦定量数据（图3），低浓度EVs提升生物膜厚度与活菌量，高浓度EVs破坏膜结构、显著降低生物量，直观证明囊泡直接调控粪肠生物膜形成，而生物膜是根管持续感染核心诱因。
4 次氯酸钠、饥饿碱性胁迫下活菌存活率数据（图4），高浓度EVs降低粪肠球菌对临床根管消毒药剂、碱性封药环境耐受能力，解释高浓度EVs可辅助根管消毒，削弱细菌抵抗临床治疗的能力。
5 牙本质、牙胶尖细菌定植扫描电镜与共聚焦定量（图5），低浓度EVs促进细菌侵入牙本质小管、大量附着牙胶充填材料，高浓度EVs抑制根管内细菌定植，降低根管残留致病菌载量。
6 巨噬细胞LDH毒性、胞内外活菌时序数据（图6），低浓度EVs增强粪肠球菌对巨噬细胞损伤、提升胞内存活能力，加重宿主炎症，高浓度EVs降低细菌免疫逃逸能力，减轻巨噬细胞损伤，且囊泡单独无细胞毒副作用。
结论
1 白色念珠菌分泌的双层膜纳米胞外囊泡对粪肠球菌具备浓度依赖性双重调控作用，0.156 μg/mL低浓度EV促进其生长与全部毒力表型，5 μg/mL高浓度EV显著抑制各类致病特征。
2 低浓度EVs可增强粪肠球菌生物膜形成、牙本质小管侵袭、牙胶尖定植、消毒耐受与巨噬细胞免疫逃逸能力，是根管真菌-细菌共感染加重持续性根尖周炎重要介质。
3 高浓度EVs能够全面抑制粪肠增殖、生物膜生成、根管定植与胁迫抗性，降低细菌在巨噬细胞内存活水平，EVs本身无宿主细胞毒性，具备根管抑菌应用潜力。
4 白色念珠菌胞外囊泡是口腔真菌与革兰氏阳性细菌跨界通讯关键信号载体，为理解混合感染发病机制提供新理论依据。
5 本研究仅开展体外实验，后续需动物体内模型进一步验证EVs对根尖炎症的干预效果。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用芬兰Bioscreen全自动微生物多孔检测仪，96孔板同步设置0.039至5 μg/mL完整EV浓度梯度与空白对照组，37℃恒温持续振荡，每小时自动读取OD600数值，24h无间断监测，无需人工分次取样涂布计数，大幅降低人力与稀释操作带来的读数误差。
2 仪器输出连续动态生长曲线，可清晰区分延滞期、对数期、稳定期不同阶段的增殖差异，仅终点菌落计数无法捕捉低浓度EV促生长、高浓度EV抑制的全过程动态变化。
3 全部培养基、细菌初始接种浓度、EV添加体系、孵育条件标准化统一，各组数据平行可比，精准筛选出高低两种特征实验浓度，为后续生物膜、组织、细胞实验提供标准化处理条件。
4 Bioscreen高通量生长定量作为基础表型证据，与生物膜电镜、离体牙定植、巨噬细胞毒性多层实验形成完整证据链，严谨证实囊泡浓度双重调控规律。
5 一次性完成多梯度囊泡平行筛选，大幅缩短浓度摸索实验周期，快速锁定关键实验处理剂量，提升整套体外研究效率。