Chromosomal integration and plasmid fusion occurring in ST20 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates coharboring blaNDM-1 and blaIMP-4 induce resistance transmission and fitness variation
携带blaNDM-1与blaIMP-4的ST20型耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌菌株中染色体整合与质粒融合驱动耐药传播与适应性改变
来源：Emerging Microbes & Infections, Volume 13, Article ID 2339942, 2024, DOI:10.1080/22221751.2024.2339942
《新发微生物与感染》，第13卷，文章编号2339942，2024年，DOI:10.1080/22221751.2024.2339942
摘要
国内临床ST20型耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CRKP）流行率逐年上升，部分菌株同时携带blaNDM-1、blaIMP-4两种金属β内酰胺酶基因，临床治疗难度极大。本研究收集全国多中心7株ST20 CRKP，开展药敏、全基因组、长读长测序、质粒图谱与接合实验。7株菌株分为两大进化分支，4株同时携带两种金属酶；blaIMP-4存在三种基因定位形式：独立IncFIB/HI1B质粒、IS26介导融合杂合质粒、LtrA介导染色体整合。IncX3型pNDM质粒具备接合转移能力，融合质粒可同步转移两种耐药基因，染色体整合型blaIMP-4无法水平传播；连续传代证实无论质粒或染色体定位，blaIMP-4拷贝数均保持稳定。利用CRISPR-Cas9敲除对应质粒构建缺失株，搭配芬兰Bioscreen C测定生长曲线：pNDM缺失会大幅降低碳青霉烯耐药水平、延长药物压力下迟滞期，单独敲除pIMP无明显耐药与适应性变化；菌株适应性、耐药强弱仅由blaNDM决定，与blaIMP基因定位无关。IS26介导质粒同源重组形成融合质粒，II类内含子LtrA介导完整质粒插入染色体；携带双金属酶的菌株对头孢他啶/阿维巴坦完全耐药，仅磷霉素、替加环素等药物体外有效。研究阐明ST20菌株多重耐药质粒融合、染色体整合分子机制，为双金属酶超级克雷伯菌院内防控提供基因组流行病学依据。
关键词
ST20肺炎克雷伯菌；耐碳青霉烯克雷伯菌；blaNDM-1；blaIMP-4；质粒融合；染色体整合；IS26；LtrA；质粒接合；细菌适应性
研究目的
1. 明确国内临床分离7株ST20 CRKP菌株克隆关系、耐药基因谱与整体药敏特征，统计双金属酶菌株流行特征。
2. 解析blaIMP-4三种不同基因组定位（独立质粒、融合质粒、染色体）的分子形成机制，阐明IS26、LtrA转座元件作用。
3. 对比不同定位blaIMP菌株的接合转移能力，评估融合质粒带来双重耐药基因共传播风险。
4. 区分blaNDM、blaIMP各自对菌株碳青霉烯耐药水平、体外生长适应性的贡献差异。
5. 验证不同基因组位置的blaIMP-4遗传稳定性，明确基因定位是否影响拷贝维持。
6. 为临床双金属酶ST20克雷伯菌感染治疗、院内传播管控提供分子流行病学数据支撑。
研究思路
1. 菌株收集与药敏检测：全国28家医院分离708株CRKP，筛选7株ST20菌株，微量肉汤稀释法测定17种抗菌药物MIC，判定耐药表型。
2. 分型与短读长基因组：cgMLST构建进化树，ABRicate、Kleborate筛查耐药、毒力基因；S1-PFGE结合Southern blot确定耐药基因质粒定位。
3. 长读长纳米孔测序：选取3代表株完整解析质粒骨架、复制子、插入序列，Easyfig比对质粒重组区域。
4. 转座单元与整合机制验证：反向PCR检测环状转座子，比对IS26、LtrA上下游同源8bp靶序列，阐明重组插入模式。
5. 接合转移实验：EC600大肠埃希菌为受体，筛选接合子PCR验证耐药基因转移能力。
6. 质粒敲除与生长动力学：CRISPR-Cas9分别消除pNDM、pIMP质粒；使用芬兰Bioscreen C在含/不含美罗培南培养基连续监测18h生长OD，计算迟滞期、生长速率。
7. 稳定性传代实验：无抗生素连续7天传代，qPCR定量blaIMP拷贝数变化，评估基因遗传稳定性。
研究亮点
1. 首次系统报道ST20 CRKP中blaIMP-4三种全新基因组存在形式：独立质粒、IS26融合杂合质粒、LtrA介导染色体整合，完整揭示两种重组通路。
2. 明确pNDM（IncX3）是决定菌株碳青霉烯高耐药与药物胁迫适应性的核心质粒，单独pIMP无显著耐药、适应性改变。
3. 融合质粒可同步携带blaNDM、blaIMP完成接合传播，大幅提升院内双重耐药菌株暴发风险，染色体整合型IMP无水平扩散能力。
4. 证实无论位于质粒还是染色体，blaIMP-4长期传代拷贝数稳定，定位不影响基因遗传稳定性。
5. 采用Bioscreen高通量生长定量，直观区分有无NDM质粒在抗生素压力下的生长迟滞差异，精准量化质粒带来适应性代价。
6. 临床药敏提示双金属酶菌株对头孢他啶/阿维巴坦全部耐药，仅少数老抗生素体外有效，给临床用药提供明确参考。
可延伸的方向
1. 大规模全国多中心测序，统计ST20菌株质粒融合、染色体整合流行率，分析抗生素使用与重组发生关联。
2. 筛选靶向IS26、LtrA的小分子抑制剂，阻断耐药质粒融合与染色体插入。
3. 动物感染模型对比携带不同定位blaIMP菌株体内定植、致病能力差异。
4. 探究美罗培南、头孢他啶/阿维巴坦长期压力是否加速质粒重组、染色体整合。
5. 构建快速多重PCR试剂盒，临床快速区分IMP质粒型、融合型、染色体整合型菌株。
6. 评估磷霉素、替加环素联合用药对双金属酶ST20菌株体内杀菌效果。
测量的数据及研究意义
1. 菌株来源、药敏MIC、cgMLST进化树数据，数据来源：表1、图1，研究意义：明确ST20在国内CRKP中排名第四，分为两大克隆簇，A簇多携带双金属酶，全部菌株对碳青霉烯类高度耐药，仅磷霉素、替加环素敏感，为临床抗感染选药提供依据。
2. S1-PFGE质粒图谱、Southern杂交、纳米孔质粒全长序列，数据来源：图1、表2，研究意义：直观区分三种blaIMP基因组定位，鉴定IncX3、IncFIB/HI1B三类复制子，定位IS26、LtrA重组断点，阐明质粒融合与染色体整合骨架来源。
3. 反向PCR环状转座子电泳、IS26同源靶序列比对，数据来源：图2，研究意义：证明IS26通过8bp同源序列介导两种质粒融合，LtrA内含子介导完整质粒插入染色体，解析两种耐药基因重排分子机制。
4. 接合转移接合子筛选、质粒图谱验证数据，研究意义：证实仅携带pNDM或融合质粒菌株可发生耐药基因水平传播，单纯染色体IMP无法转移，评估院内扩散风险等级。
5. Bioscreen仪器18h生长OD、迟滞期统计数据，数据来源：图4，研究意义：无药环境下各株生长无差异；美罗培南胁迫下敲除pNDM菌株迟滞期显著延长，直接证明NDM质粒是菌株抗生素适应性核心决定因子。
6. 7天连续传代blaIMP qPCR拷贝定量，研究意义：质粒、染色体上blaIMP拷贝数无统计学差异，说明基因定位不影响其遗传稳定性，整合菌株可长期保留IMP耐药表型。
7. CRISPR质粒敲除株药敏MIC对比数据，数据来源表3，研究意义：单独敲除pIMP菌株耐药无明显变化，敲除pNDM后碳青霉烯MIC下降至少8倍，明确两种金属酶对耐药贡献度差异。
结论
1. 国内ST20型CRKP分为两大克隆分支，A簇菌株高频共携带blaNDM-1与blaIMP-4双金属酶，对头孢他啶/阿维巴坦完全耐药，仅磷霉素、替加环素体外敏感。
2. blaIMP-4存在三种稳定基因组定位：独立IncFIB/HI1B质粒、IS26介导NDM-IMP融合杂合质粒、LtrA内含子介导染色体完整插入，两种重组机制完全不同。
3. IncX3型pNDM质粒可自主接合转移，融合质粒能同步传播两种耐药基因；染色体整合型blaIMP无水平传播能力，院内暴发风险更低。
4. 无论定位于质粒或染色体，blaIMP-4经7天无药传代拷贝数稳定，基因定位不影响其遗传稳定性。
5. pNDM是决定菌株碳青霉烯高水平耐药、抗生素压力下生长适应性的关键元件；单独pIMP质粒缺失不会改变菌株耐药与体外生长表型。
6 IS26、LtrA是驱动多重耐药质粒重组、耐药基因染色体整合核心移动元件，是ST20克隆多重耐药持续进化重要分子基础。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1. 96孔高通量微孔板体系，同步设置野生株、敲除ΔNDM、ΔIMP、双敲除多组菌株，分无抗生素、美罗培南胁迫两组培养基，37℃持续振荡，每5分钟自动读取OD600，连续监测18h完整生长全过程。
2. 全程密闭恒温自动化检测，规避人工分次取样、温度波动、开盖污染带来系统误差，所有组别生长曲线可直接统计学对比，迟滞期、生长速率量化结果客观可靠。
3. 区分无药物基础生长与抗生素胁迫两种环境，证明无选择压力下各类质粒缺失株生长无差别，仅美罗培南暴露时pNDM缺失菌株出现显著生长延迟，精准剥离质粒带来的药物特异性适应性代价。
4. 微量培养体系大幅节约美罗培南、MH肉汤试剂，适合多敲除突变株批量适应性筛选，减少平板计数人工工作量。
5. 仪器自动输出连续时序OD数值，可直接作图并进行方差检验，不用肉眼主观判读生长强弱，为“NDM质粒主导抗生素适应性”核心结论提供连续动态定量证据。
6. 生长动力学数据与药敏、接合、基因组测序多层次结果交叉印证，建立“质粒重组—耐药基因定位—传播能力—细菌适应性”完整证据链。