A Recombinant Shigella flexneri Strain Expressing ETEC Heat-Labile Enterotoxin B Subunit Shows Promise for Vaccine Development via OMVs
一株表达产肠毒素大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基的重组福氏志贺菌通过外膜囊泡开发疫苗具备潜力
来源：International Journal of Molecular Sciences, Volume 25, Article ID 12535, 2024, DOI:10.3390/ijms252312535
《国际分子科学杂志》第25卷，文章编号12535，2024年，DOI：10.3390/ijms252312535
摘要
志贺菌与产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是全球腹泻病主要致病菌，目前无获批商用疫苗，多重耐药问题持续加剧。本研究将ETEC热不稳定肠毒素B亚基编码基因eltb整合至野生型福氏志贺菌、高囊泡分泌ΔtolR突变株基因组，构建两株重组菌株。GM1捕获ELISA证实重组菌株可稳定表达与ETEC水平相当的LTB蛋白，菌体与上清液中均检出LTB；透射电镜、粒径电位分析显示重组菌株可正常分泌外膜囊泡（OMV）与热处理囊泡（HT-OMV）；定量蛋白组证明囊泡同时携带志贺菌主要外膜蛋白、毒力蛋白与ETEC来源LTB；生长曲线（Bioscreen）结果表明eltb插入不改变菌株代时，但ΔtolR重组株稳定期菌体密度更低；重组菌生物膜形成能力显著提升，GM1受体可逆转该表型；细胞毒性实验证实两类囊泡对He细胞无明显损伤。该重组志贺菌外膜囊泡可作为双致病菌亚单位疫苗候选物，同时诱导抗志贺菌、ETEC免疫保护。
关键词
福氏志贺菌；产肠毒素大肠杆菌；热不稳定肠毒素B亚基；外膜囊泡；重组疫苗；蛋白组；细菌生长；生物膜；细胞毒性
研究目的
1 将ETEC的eltb基因整合至野生福氏志贺菌与ΔtolR突变株染色体，构建稳定表达LTB的重组菌株，验证LTB蛋白表达水平。
2 表征重组菌株分泌的OMV、HT-OMV粒径、电位、形态，解析囊泡蛋白组组成变化。
3 探究eltb插入对细菌生长、抗生素敏感性、生物膜形成表型的影响，阐明LTB调控生物膜的分子机制。
4 评估重组囊泡对HeLa上皮细胞的细胞毒性，验证疫苗载体安全性。
5 评估该外膜囊泡作为志贺菌、ETEC双价亚单位疫苗的开发潜力。
研究思路
1 基因工程构建：扩增eltb启动子与编码序列，利用自杀Tn7载体电转化导入野生型、ΔtolR福氏志贺菌，PCR测序验证基因整合（材料方法）。
2 LTB表达验证：GM1捕获ELISA检测菌体、上清中LTB蛋白含量，对比ETEC阳性对照。
3 囊泡分离与理化表征：化学灭活、热处理分别制备OMV、HT-OMV，马尔文仪器测粒径与Zeta电位，透射电镜观测囊泡形态。
4 定量蛋白组分析：LC-MS/MS检测野生/重组菌株囊泡蛋白，对比LTB、外膜蛋白、毒力因子表达差异。
5 菌株生长检测：Bioscreen C仪器连续22h测定各菌株OD生长曲线，计算代时，同步检测全谱抗生素MIC。
6 生物膜实验：结晶紫染色定量生物膜量，添加GM1验证LTB介导粘附作用。
7 细胞毒性实验：梯度浓度囊泡处理HeLa细胞，MTT检测细胞存活率。
8 整合所有体外表型数据，评估重组OMV疫苗开发价值。
研究亮点
1 首次将eltb稳定整合志贺菌染色体，区别于不稳定毒力质粒载体，实现LTB持续稳定表达。
2 ΔtolR突变背景重组株囊泡产量更高，囊泡同时携带志贺菌全套免疫抗原与ETEC LTB，实现双病原靶向。
3 证实LTB蛋白可显著提升细菌生物膜形成能力，GM1受体结合可阻断该效应，明确LTB促粘附功能。
4 重组菌株生长、抗生素敏感性无明显改变，囊泡无上皮细胞毒性，疫苗平台安全性良好。
5 提供无需活减毒菌的非复制型囊泡疫苗方案，储存运输稳定性优于传统活菌疫苗，适配资源匮乏地区。
可延伸的方向
1 开展小鼠体内黏膜免疫实验，检测重组OMV诱导特异性抗体与抗感染保护效力。
2 优化囊泡纯化工艺，提升LTB蛋白载量，降低生产制备成本。
3 构建多抗原串联重组志贺菌，拓展疫苗覆盖致病菌血清型。
4 探究口服、黏膜多种给药途径的免疫应答差异，优化免疫方案。
5 联合小分子佐剂共孵囊泡，进一步提升黏膜免疫应答强度。
测量的数据及研究意义
1 GM1-ELISA LTB定量数据（图1），证明两株重组志贺菌LTB表达量与ETEC标准株无显著差异，证实LTB均匀分布于菌体与培养上清，菌株可分泌该外源蛋白。
2 囊粒径、Zeta电位统计表（表1），eltb插入不会大幅改变囊泡基础理化特征，热处理HT-OMV整体粒径更小，Δtol菌株囊泡粒径更大、电负性更强，适合作为抗原递送载体。
3 囊泡透射电镜成像（图2），直观观察各组球形囊泡结构，证实重组菌株可正常分泌完整囊泡颗粒，区分原生囊泡与热处理囊泡形态细微差异。
4 定量蛋白组LTB丰度、差异蛋白火山图（图3、图4），证实重组OMV、HT-OMV均含有LTB，ΔtolR株外膜免疫蛋白表达上调，明确eltb插入重塑囊泡蛋白谱，富集免疫优势抗原，提升疫苗潜力。
5 Bioscreen细菌生长动力学曲线（图5），野生株与eltb重组株生长速率、代时完全一致，基因插入无生长缺陷，ΔtolR重组株进入稳定期后菌体密度更低、衰亡期提前，不影响基础增殖。
6 生物膜结晶紫定量数据（图6），表达LTB菌株生物膜形成能力显著上升，GM1可竞争性抑制该粘附作用，阐明LTB通过GM1受体介导细菌表面粘附，解释肠道定植相关机制。
7 HeLa细胞MTT存活率数据（图7），各浓度OMV、HT-OMV处理后细胞存活率均高于60，无明显细胞毒性，证明该囊泡疫苗载体体外上皮细胞安全性达标。
结论
1 成功构建染色体稳定整合eltb的野生、ΔtolR福氏志贺重组株，菌株可持续分泌与ETEC等量LTB蛋白，外源蛋白可释放至胞外上清。
2 重组菌株分泌的OMV、HT-OMV形态完整，同时携带志贺菌主要毒力、外膜抗原与ETEC来源LTB，是双价抗原递送载体。
3 eltb基因插入不改变细菌基础生长特性与抗生素耐药表型；LTB蛋白通过GM1受体促进细菌生物膜粘附，不产生细胞毒性。
4 ΔtolR突变菌株囊泡产量更高，囊泡内免疫相关蛋白丰度提升，更适用于疫苗原料制备。
5 该重组志贺菌外膜囊泡无复制能力、稳定性高，可作为同时防控志贺菌、产肠毒素大肠杆菌腹泻的新型亚单位疫苗候选。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用芬兰Bioscreen C全自动多孔微生物检测仪，96孔同步平行所有实验菌株，37℃持续振荡，每10分钟自动读取OD580数值，连续监测22h全程生长，无需人工多次取样稀释测浊，大幅减少人为操作引入误差与实验人力。
2 仪器完整记录延滞期、对数期、稳定、衰亡全阶段动态OD变化，可精准计算菌株代时，单点终点OD无法捕捉ΔtolR重组株后期菌体衰减特征。
3 所有菌株接种浓度、培养基、孵育条件完全标准化，数据平行性强，可直接对比有无eltb、有无tolR缺失带来的生长差异，证明外源基因插入不损伤细菌基础增殖能力。
4 Bioscreen生长曲线作为基础生理对照，与蛋白组、生物膜、细胞毒性数据形成完整证据链，排除生长差异干扰表型解读。
5 高通量多孔检测一次性完成四株菌株重复生长测定，无需分多批次摇瓶培养，大幅缩短菌株生理表型验证周期。