Effect of the catabolic control protein A of Lactiplantibacillus plantarum AR113 on its colonization in vivo
分解代谢调控蛋白A对植物乳杆菌AR113体内定殖能力的影响
来源：Food Frontiers, Volume 5, Pages 1796–1805, 2024, DOI:10.1002/fft2.378
《食品前沿》第5卷，页码1796-1805，2024年，DOI：10.1002/fft2.378
摘要
分解代谢调控蛋白CcpA是革兰氏阳性菌碳分解物阻遏效应核心调控因子，碳代谢直接影响益生菌肠道存活与定殖，但CcpA调控碳代谢如何影响植物乳杆菌体内定殖尚不明确。本研究利用CRISPR/Cas9构建植物乳杆菌AR113的ccpA敲除菌株AR113ΔccpA。体外生长实验显示敲除株最大OD生物量下降0.34，延滞期延长2.63 h，胆汁盐耐受显著变差；细胞粘附、自聚集、共聚集、菌体疏水性无显著变化。小鼠单次灌胃实验中，两种菌株肠道黏液层菌群数量变化趋势一致，但肠腔48 h时野生株载量是敲除株的34倍；持续多天饲喂标记菌株后，二者肠道最长定殖时长无差异。研究证实ccpA缺失会削弱植物乳杆菌肠道增殖能力，但不会改变其体内定殖持续时间，为碳代谢调控益生菌肠道适应性提供实验依据。
关键词
植物乳杆菌；CcpA；碳分解物阻遏；碳代谢；益生菌；肠道定殖；胆汁盐耐受；CRISPR基因编辑；生长动力学
研究目的
1 构建植物乳杆菌AR113 ccpA基因敲除突变株，探究CcpA缺失对菌株体外生长、环境耐受、聚集粘附等生理特性的影响。
2 对比野生株与ccpA敲除株在小鼠肠道黏液、肠腔内的菌群丰度差异，明确CcpA对肠道增殖的调控作用。
3 探究ccpA缺失是否改变植物乳杆菌在小鼠肠道的长期定殖维持时长。
4 阐明碳代谢全局调控蛋白CcpA介导益生菌肠道适应与定殖的关联机制。
研究思路
1 基因编辑载体构建：扩增ccpA上下游同源片段与sgRNA片段，无缝组装敲除质粒pLdccpA，电转入携带RecE/T辅助质粒的AR113感受细胞，筛选PCR验证敲除菌株。
2 体外生理测定：采用芬兰Bioscreen仪器记录标准MRS、不同胆汁盐、不同pH培养基下菌株24 h生长曲线，计算最大生物量、延滞期、比生长速率；同步检测菌体疏水性、自聚集、共聚集、HT29细胞粘附能力。
3 荧光标记菌株构建：将rf红色荧光蛋白整合至野生与敲除株基因组，验证荧光表达稳定性；cFDA-SE染料标记菌株，流式检测标记效率。
4 小鼠单次灌胃实验：分别饲喂标记野生/敲除菌，分时段收集十二指肠、空肠、回肠、结肠黏液与肠内容物，荧光定量菌群载量。
5 连续饲喂定殖实验：持续6天灌胃菌株，每日收集粪便检测荧光强度，追踪菌株肠道留存时长。
6 整合体外生理与动物体内定殖数据，解析CcpA的功能双重效应。
研究亮点
1 首次通过CRISPR/Cas9构建植物乳杆菌ccpA无痕敲除株，系统完整对比野生与突变株体外、体内全套生理表型。
2 明确CcpA缺失仅抑制菌株体外增殖与胆汁盐耐受，不改变菌体聚集、细胞粘附等表面相关特性。
3 区分CcpA的双重调控作用：大幅降低细菌在肠腔内增殖数量，但不影响肠道黏液层附着与长期定殖维持时间。
4 证明肠道黏液环境可缓冲碳代谢缺陷带来的增殖劣势，解释体外生长缺陷菌株仍能长期定植的现象。
5 结合Bioscreen高通量生长定量、流式荧光、活体动物荧光定量多层次数据，完整建立碳代谢与益生菌肠道适应关联模型。
可延伸的方向
1 转录组测序对比野生株与ΔccpA，解析CcpA全局调控的碳代谢、应激相关靶基因网络。
2 回补不同截短型ccpA，明确关键功能结构域对生长与肠道定殖的调控作用。
3 在多种肠道微环境（不同碳源、胆汁浓度）下测试突变株，模拟不同宿主肠道条件。
4 改造ccpA启动子实现可控表达，精准调控益生菌肠道增殖效率。
5 动物炎症模型中探究ccpA缺失菌株的肠道免疫调节功能变化。
测量的数据及研究意义
1 Bioscreen全自动24 h生长动力学OD数据（图2，表1、表2），量化MRS、梯度胆汁盐、梯度pH下两株菌最大生物量、延滞期、最大比生长速率差异，直观证明ccpA缺失显著抑制细菌增殖，胆汁胁迫下生长缺陷进一步加剧，pH耐受无明显变化。
2 菌体疏水性、自聚集、共聚集、细胞粘附定量数据（图2H），四类表型野生与敲除株无统计学差异，说明CcpA不调控菌体表面粘附相关理化特性，体内增殖差异并非粘附能力导致。
3 流式细胞荧光标记效率数据（图3A、3B），菌株荧光标记率超98%，保证后续小鼠肠道菌群荧光定量检测准确可靠。
4 单次灌胃肠道黏液、肠腔菌群荧光定量（图3C-J），各肠段黏液层两种菌株数量变化趋势完全一致，肠腔48 h野生株载量为敲除株34倍，证明碳代谢缺陷大幅削弱肠内增殖能力。
5 连续饲喂粪便荧光时序数据（图4E），两株菌均可在小鼠肠道稳定定植长达两周，说明CcpA调控仅影响增殖速率，不决定菌株肠道留存时长。
6 敲除质粒、菌株PCR电泳鉴定图（图1、图4A），验证基因编辑载体与突变株构建成功，排除菌株基因型混杂干扰实验结果。
结论
1 ccpA敲除显著抑制植物乳杆菌AR113体外生长，延长延滞期、降低最大菌体浓度，同时提升胆汁盐敏感性，但不影响菌体疏水性、聚集能力与肠道上皮细胞粘附水平。
2 单次灌胃小鼠模型中，ccpA缺失菌株在各肠道黏液层的丰度变化趋势与野生株无差异，但肠腔内细菌数量大幅下降，48 h差异可达34倍。
3 持续多天饲喂实验证实，ccpA缺失不会缩短植物乳杆菌在小鼠肠道的最长定殖时间，两种菌株均可稳定定植两周。
4 CcpA作为碳代谢全局调控因子，主要通过调控细菌增殖能力影响肠腔菌群丰度，肠道黏液环境可弥补其碳代谢缺陷带来的增殖劣势。
5 碳分解物阻遏通路仅调控益生菌肠道增殖效率，不决定其肠道长期定殖留存能力，为益生菌定向改造提供理论依据。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用芬兰Bioscreen全自动微生物生长分析仪，96孔微孔同步批量培养野生株、ccpA敲除株，设置无胆汁、0.2%、0.3%、0.4%胆汁盐以及pH3.0/3.5/4.0多组胁迫条件，37℃恒温持续振荡，每30 min自动采集OD600，全程无需人工定时取样稀释涂布，大幅减少人工操作带来的读数误差与实验工作量。
2 仪器可完整记录0–24 h完整生长周期，精准区分延滞期、对数期、稳定期，自动计算最大生物量、延滞时长、最大比生长速率三项定量指标，单点终点OD无法捕捉延滞期这类细微生长差异。
3 全部实验组培养基、接种初始OD、孵育环境完全标准化，数据平行性、统计学可比性强，可直观量化胆汁胁迫会放大ccpA缺失造成的生长缺陷。
4 Bioscreen体外生长数据作为基础生理证据，与细胞粘附、小鼠体内定殖荧光定量数据形成完整证据链，区分“体外增殖缺陷”和“体内粘附/定殖时长”两类独立表型。
5 高通量多孔并行模式一次性完成多胁迫梯度生长筛选，无需分多批次摇瓶重复培养，大幅缩短菌株生理特性初筛周期。