A single point mutation in the Listeria monocytogenes ribosomal gene rpsU enables SigB activation independently of the stressosome and the anti-sigma factor antagonist RsbV
单核细胞增生李斯特菌核糖体基因rpsU单点突变可不依赖应激体与抗σ因子拮抗蛋白RsbV激活SigB
来源：Frontiers in Microbiology, Volume 15, Article ID 1304325, 2024, DOI:10.3389/fmicb.2024.1304325
《微生物前沿》第15卷，文章编号1304325，2024年，DOI：10.3389/fmicb.2024.1304325
摘要
单核细胞增生李斯特菌是食源致病菌，σ因子SigB介导通用应激耐受通路，经典激活通路依赖应激体RsbR1与拮抗蛋白RsbV。已有研究发现rpsU（编码核糖体蛋白S21）G50C单点突变菌株耐酸、耐热能力显著提升，但生长速率下降，该表型背后调控机制尚不清晰。本研究构建野生型、ΔsigB、ΔrsbR1、ΔrsbV单突变株及对应rpsU G50C双突变株，结合表型测定与定量蛋白组学开展解析。结果显示，rpsU突变株的SigB通路激活、多重胁迫抗性提升现象完全不依赖应激体核心蛋白RsbR1和RsbV；敲除sigB后突变株胁迫优势完全消失，证明抗性提升由SigB介导。而突变株最大比生长速率降低的表型与SigB激活无关，推测源于核糖体翻译功能受损。蛋白组数据证实ΔrsbV背景下rpsU突变仍能大量上调SigB调控子蛋白；RsbW/SigB蛋白比例变化无法解释该非经典激活模式，磷转运蛋白PstS上调也不直接参与胁迫表型调控。本研究发现李斯特菌存在不依赖RsbR1、RsbV的SigB新型激活途径，同时明确rpsU突变带来的胁迫抗性与生长代价分属两条独立调控通路。
关键词
单核细胞增生李斯特菌；rpsU；核糖体蛋白S21；SigB；应激体；RsbV；多重胁迫耐受；蛋白组；生长适合度；食源致病菌
研究目的
1 明确rpsU G50C单点突变提升李斯特菌耐酸、耐热能力是否依赖SigB通路。
2 验证该突变激活SigB是否需要经典上游信号元件应激体RsbR1与拮抗蛋白RsbV。
3 区分rpsU突变引发的胁迫抗性提升、生长速率下降两种表型是否由同一通路调控。
4 筛选并验证可能介导非经典SigB激活的候选蛋白（PstS等），排除无关调控因子。
5 结合表型与定量蛋白组数据，提出核糖体突变调控SigB的新型分子模型。
研究思路
1 菌株构建：利用温敏自杀质粒构建EGDe野生株、ΔsigB、ΔrsbR1、ΔrsbV单缺失株，以及各基因背景下rpsU G50C双突变株；全基因组测序验证无额外非目标突变。
2 胁迫耐受实验：37℃ pH3酸处理15 min、60℃热处理5 min，测定各组活菌下降对数，对比胁迫存活率差异。
3 生长动力学测定：采用Bioscreen仪器30℃、37℃分别测定所有菌株生长曲线，计算最大比生长速率μmax。
4 定量标记蛋白组：各组对数晚期菌体裂解进行nLC-MS/MS定量，筛选差异蛋白，富集SigB调控子、KEGG通路。
5 RsbW/SigB丰度比值统计：基于蛋白组定量数据计算各组两种蛋白相对含量，分析比例与SigB激活关联性。
6 PstS功能验证：构建Δpst单突变、Δpst-rpsU双突变株，重复胁迫与生长实验，验证PstS是否参与表型调控。
7 整合全部表型、蛋白组数据，梳理rpsU突变双重表型的独立调控通路。
研究亮点
1 首次在单核细胞增生李斯特菌中发现不依赖应激体RsbR1、RsbV的SigB非经典激活通路，打破传统SigB激活调控模型认知。
2 明确rpsU突变带来的多重胁迫抗性完全依靠SigB，但生长抑制表型与SigB通路无关，二者遗传调控通路相互独立。
3 排除RsbW/SigB蛋白丰度比值改变、磷转运蛋白PstS上调两种假说，证明二者均不是SigB旁路激活的核心介质。
4 核糖体蛋白单点突变可重塑细菌应激响应，揭示核糖体稳态作为上游信号调控通用应激通路全新机制。
5 结合Bioscreen高通量生长、胁迫活菌计数、定量蛋白组多维度证据，完整区分细菌“胁迫抗性-生长适合度”权衡的两套独立调控网络。
可延伸的方向
1 生化体外互作实验，解析突变型RpsU如何直接或间接干扰RsbW-SigB抑制复合物。
2 鉴定HflXr、Obg等核糖体相关GTP酶在旁路SigB激活中的功能。
3 临床分离不同谱系李斯特菌中检测rpsU突变频率，评估该突变在食品环境中的进化优势。
4 改造rpsU定点突变，筛选可平衡胁迫抗性与生长速率的工程菌株。
5 靶向该非经典SigB通路开发食品抑菌小分子，抑制致病菌环境耐受能力。
测量的数据及研究意义
1 酸、热胁迫后活菌对数下降数据（图1），直观证明rpsU突变株耐酸耐热显著提升；ΔsigB背景下该优势完全消失，确认抗性依赖SigB，ΔrsbR1、ΔrsbV双突变株仍具备胁迫抗性，证实SigB激活无需应激体与RsbV。
2 Bioscreen测定最大比生长速率μmax（图2），30、37℃两个温度下所有rpsU突变株生长速率均显著降低，包含Δsig-rpsU双突变株，直接证明生长抑制表型独立于SigB激活，该代价来源于核糖体功能缺陷而非应激通路耗能。
3 定量蛋白组火山图、差异蛋白韦恩图（图3、图4），野生型、ΔrsbV背景下rpsU突变均大量上调Sig调控子蛋白，从分子层面证实旁路Sig激活，筛选共上下调蛋白集，锁定PstS等候选调控因子，为后续功能验证提供靶标。
4 RsbW与SigB蛋白丰度比值定量（图5），rpsU突变株RsbW:SigB比值并未降低，甚至ΔrsbV双突变比值更高，排除“Sig游离增多”这一简单解释，说明存在全新作用机制。
5 Δpst系列突变株胁迫、生长表型数据，pstS敲除无法消除rpsU突变带来的耐胁迫与生长缺陷，证明磷转运蛋白PstS上调仅为伴随现象，不介导核心表型变化。
6 菌株构建、测序验证数据表（表1、表2），确认所有突变株仅含目标位点突变，排除其他SNP干扰实验结果，提供完整菌株、引物资源，可重复开展通路验证实验。
结论
1 李斯特菌rpsU G50C核糖体单点突变可激活SigB依赖的多重胁迫耐受通路，该激活过程完全不依赖应激体核心蛋白RsbR1和抗σ拮抗因子RsbV，存在新型SigB旁路激活机制。
2 rpsU突变产生两种独立表型：SigB介导的耐酸、耐热能力提升，以及与SigB无关的最大生长速率下降，生长劣势源于核糖体翻译功能受损。
3 RsbW与SigB蛋白相对丰度变化不能解释旁路SigB激活，磷转运蛋白PstS上调也不直接参与胁迫耐受调控。
4 核糖体蛋白突变可作为上游信号重塑细菌通用应激响应，拓展核糖体稳态调控细菌抗逆的分子认知。
5 本研究揭示致病菌胁迫抗性与生长适合度的权衡存在两条互不耦合调控通路，为食品防腐、致病菌毒力调控提供新靶点。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用芬兰Bioscreen高通量微生物生长分析仪，100孔蜂窝板同步平行所有单、双突变菌株，30℃与37℃两组温度分别测定，每10 min自动采集OD600，全程无需人工分批取样稀释涂布，大幅减少人为操作误差与实验工作量。
2 仪器连续记录完整生长曲线，通过到达检测时间TTD精准计算最大比生长速率μmax，仅终点OD无法定量菌株增殖动力学细微差异，可清晰区分各组生长劣势强弱。
3 全部菌株培养基、接种初始浊度、振荡孵育条件标准化，数据统计学平行度高，直接对比有无rpsU突变、有无sigB敲除菌株的生长差异，明确生长缺陷独立于Sig通路。
4 生长动力学数据与胁迫活菌计数、蛋白组分子数据形成完整证据链，分别佐证“生长代价”“胁迫抗性”两套独立表型，完善机制推导的严谨性。
5 高通量多孔并行检测一次性完成十余株突变株平行生长筛选，无需多批次摇瓶重复，大幅缩短菌株生长表型验证周期。