Genome‑wide identification of fitness‑genes in aminoglycoside‑resistant Escherichia coli during antibiotic
抗生素胁迫下氨基糖苷耐药大肠杆菌适应度基因的全基因组筛选鉴定
来源：Scientific Reports, Volume 14, Article ID 4163, 2024, DOI:10.1038/s41598-024-54169-8
《科学报告》第14卷，文章编号4163，2024年，DOI：10.1038/s41598-024-54169-8
摘要
氨基糖苷类抗生素耐药问题已严重威胁人畜健康，现有研究缺少耐药菌暴露于对应抗生素时细胞适应机制的系统解析。本研究以分别携带链霉素、庆大霉素、新霉素耐药质粒的大肠杆菌MG1655为材料，构建三套高密度Tn5转座子突变文库，利用转座子插入测序（TraDIS）技术，在亚抑菌浓度抗生素胁迫下筛选条件必需适应度基因。共筛选得到106个关键适应基因：链霉素组56个、庆大霉素组39个、新霉素组32个，仅polA、pcnB、atpE三个基因为三类抗生素共同必需。多数适应基因定位于细胞膜，链霉素、庆大霉素相关基因富集细胞分裂、ATP合成、应激通路，新霉素特异基因集中于肠杆菌共同抗原合成、镁离子感知转运通路。选取minCDE、hflCK、cpxR、clsA、wecA、phoPQ、lpp、pal共8个基因构建敲除株，MIC、共竞争生长实验验证：缺失后菌株在对应抗生素环境中生长竞争力显著下降。本研究系统揭示氨基糖苷耐药菌应对药物胁迫的细胞通路，筛选得到多个潜在增敏辅助药物靶点，为逆转细菌氨基糖苷耐药提供新思路。
关键词
氨基糖苷类抗生素；大肠杆菌；细菌耐药；TraDIS转座子测序；适应度基因；条件必需基因；细胞膜稳态；细胞分裂；氧化磷酸化；肠杆菌共同抗原
研究目的
1 利用TraDIS高通量转座子测序，分别筛选链霉素、庆大霉素、新霉素耐药大肠杆菌在对应亚抑菌药物压力下的适应度基因。
2 分类注释全部筛选基因功能，对比三类抗生素胁迫下基因富集通路的共性与特异性差异。
3 筛选8个代表性适应基因构建单基因敲除突变株，通过生长、最低抑菌浓度、共竞争实验验证基因功能。
4 阐明细胞膜、能量代谢、细胞分裂、ECA合成等通路在耐药菌抵御氨基糖苷毒性中的分子作用。
5 挖掘可作为辅助增敏药物的细菌靶标基因，为克服氨基糖苷耐药提供分子基础。
研究思路
1 菌株构建：将携带aph(3″)-Ib/aph(6)-1d、aac(3)-IV、aph(3′)-Ia耐药质粒分别导入MG1655，获得三类稳定耐药菌株，测定各自MIC值。
2 转座文库构建：Tn5转座电转化构建三套高密度突变文库，无抗生素培养获得输入文库；分别添加1/2 MIC对应抗生素培养得到药物处理输出文库。
3 TraDIS测序分析：提取输入、输出文库基因组DNA建库测序，对比转座子插入丰度，筛选log2FC<-2、q<0.01的适应基因，进行GO/KEGG功能富集。
4 生物信息分析：STRING互作网络分析基因通路关联，比对三类文库共有、特有基因，绘制韦恩图。
5 单基因敲除验证：Lambda Red系统构建8个候选基因缺失株，转入对应耐药质粒获得敲除耐药菌株。
6 生长动力学检测：采用Bioscreen仪器连续记录野生、敲除株在含对应抗生素培养基的OD生长曲线。
7 MIC与共竞争实验：微量稀释法测定各菌株MIC；耐药野生株与敲除株共培养24h，测序定量突变株丰度。
8 同源性分析：靶蛋白与人源蛋白序列比对，评估药物靶点安全性；与其他耐药菌适应基因数据集交叉对比。
9 整合测序、表型数据，建立氨基糖苷胁迫下大肠杆菌适应调控模型。
研究亮点
1 首次利用三套独立高密度TraDIS文库，完整对比三种临床常用氨基糖苷耐药大肠杆菌的全基因组适应基因谱，区分药物特异与共有调控通路。
2 发现仅polA、pcnB、atpE为三类抗生素通用适应基因，细胞膜相关蛋白是抵御氨基糖苷毒性的核心因子。
3 明确链霉素、庆大霉素依赖细胞分裂、膜应激通路维持存活，新霉素特异性依赖ECA合成与镁感知系统，揭示药物作用机制差异。
4 共竞争实验证实单基因缺失会大幅削弱耐药菌在药物环境中的生存竞争力，相比单一生长曲线验证更贴近自然竞争环境。
5 筛选一批与人蛋白无同源的细菌特异靶基因，具备开发安全增敏佐剂药物的潜力，用于恢复氨基糖苷药效。
可延伸的方向
1 针对cpxR、lpp、wecA等关键适应基因开发小分子抑制剂，体外联合氨基糖苷验证增敏效果。
2 在临床分离多重耐药产肠毒素大肠杆菌中重复TraDIS筛选，验证本研究适应基因保守性。
3 构建多基因联合敲除菌株，探究通路协同作用对氨基糖苷敏感性的影响。
4 开展小鼠肠道感染体内实验，验证靶标抑制剂在动物体内逆转耐药的实际效果。
5 拓展至妥布霉素、阿米卡星等其他氨基糖苷药物，完善完整适应基因调控网络。
测量的数据及研究意义
1 三类耐药菌株MIC检测数据，明确各菌株对应抗生素亚抑菌筛选浓度，为TraDIS药物处理条件提供依据，确定敲除株药物敏感性变化幅度，直观反映适应基因缺失带来的耐药衰减。
2 TraDIS测序插入丰度、韦恩图、功能富集统计（图1），批量筛选106个药物适应基因，划分三类抗生素共有/特有基因，功能富集清晰区分不同氨基糖苷胁迫下细胞核心应答通路，解释药物毒性作用差异。
3 STRING蛋白互作网络，展示适应基因之间调控关联，挖掘关键通路核心枢纽基因，为后续单基因功能验证提供优先筛选靶点。
4 Bioscreen全自动细菌生长动力学OD时序数据（图2、图4），连续24h记录野生与敲除株在亚抑菌抗生素下完整生长周期，直观显示敲除株延滞期延长、生长速率下降，单菌株纯培养表型初步验证基因是维持药物环境生长必需因子。
5 突变株与野生株共竞争丰度测序数据（图3），模拟体内菌群竞争环境，证明适应基因缺失菌株在药物压力下被野生株显著淘汰，相比单一生长曲线，更真实反映基因对细菌体内适应度的贡献。
6 靶蛋白人源同源性比对数据，确认8个验证基因编码蛋白无人类同源序列，证明以此为靶点的抑制剂对人体细胞毒性风险低，具备药物开发价值。
7 不同抗生素耐药菌适应基因交叉比对统计，找到cpxR、lpp等多种抗生素通用适应基因，提示可开发广谱抗菌增敏辅助药物，适配多类耐药菌感染。
结论
1 本研究通过三套Tn5转座子TraDIS文库，筛选得到106个氨基糖苷耐药大肠杆菌药物适应度基因，其中polA、pcnB、atpE为链霉素、庆大霉素、新霉素三类药物共同必需基因。
2 绝大多数适应基因定位于细胞膜结构；链霉素、庆大霉素胁迫下细菌主要依靠细胞分裂、ATP合成、膜应激通路存活，新霉素胁迫特异性依赖肠杆菌共同ECA合成与PhoPQ镁离子感知通路。
3 minCDE、hflCK、cpxR、clsA、wecA、phoPQ、lpp、pal八个基因缺失后，耐药菌株在对应抗生素中生长能力显著受损，MIC出现2–4倍下降，共竞争条件下突变株丰度大幅降低。
4 筛选得到的适应蛋白与人源蛋白无序列同源，可作为低毒辅助药物靶点，通过抑制该类蛋白恢复氨基糖苷类抗生素对耐药菌的杀菌活性。
5 TraDIS筛选结果结合纯培养、共竞争多重表型验证，完整阐明氨基糖苷耐药菌应对药物胁迫的细胞适应机制，为解决临床氨基糖苷耐药危机提供理论与靶标资源。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用Bioscreen C高通量微生物生长分析仪，100孔蜂窝板同步批量检测野生型及8种基因敲除耐药菌株，设置无药对照组与亚抑菌抗生素处理组，37℃持续振荡，每20分钟自动采集OD600，全程无需人工定时取样稀释，大幅减少人为操作带来的读数偏差与实验人力消耗。
2 仪器可连续记录长达24小时完整细菌生长全过程，清晰区分延滞期、对数期、稳定期的细微生长差异，单点终点OD无法捕捉敲除株生长迟滞、增殖速率下降等动态缺陷，精准量化基因缺失带来的生长劣势。
3 所有实验组培养基、接种初始菌浊、抗生素添加浓度、孵育环境完全标准化，各组数据统计学平行性、可比性强，可直观对比不同敲除株受药物抑制的严重程度，快速筛选影响最大的核心适应基因。
4 Bioscreen生长曲线作为单菌株体外基础表型证据，与共竞争测序体内模拟实验形成互补证据链，单独纯培养证明基因直接调控细菌药物耐受能力，共竞争实验进一步证实该适应优势在菌群竞争环境下真实存在，完善结论可靠性。
5 高通量多孔并行检测模式可一次性完成全部敲除株平行生长实验，无需分多批次摇瓶培养，大幅缩短候选基因功能初筛周期，提升整套验证实验效率。