Construction of an arrayed CRISPRi library as a resource for essential gene function studies in Streptococcus mutans
构建阵列化CRISPRi文库用于变形链球菌必需基因功能研究
来源：Microbiology Spectrum, Volume 12, Issue 1, 2024, DOI:10.1128/spectrum.03149-23
《微生物学谱》，第12卷第1期，2024年，DOI：10.1128/spectrum.03149-23
摘要
阵列突变文库是细菌遗传学核心研究工具，但传统缺失/转座文库无法覆盖细菌必需基因，CRISPR干扰（CRISPRi）技术可可逆抑制必需基因实现高通量功能筛选。本研究以致龋菌变形链球菌UA159为材料，构建命名为SNAP的阵列化CRISPRi文库，文库包含270株菌株，可木糖诱导靶向抑制250余个必需、生长关键基因，每株菌株携带单一靶向sgRNA。文库分三块96孔板低温保藏，可通过复制针快速扩增复制品。功能验证显示：营养丰富培养基中菌株无明显生长缺陷；添加木糖诱导抑制后大量菌株出现生长受损；利用文库高通量筛选生物膜形成、氟化钠、西吡氯铵（CPC）响应表型，证实该文库可用于必需基因功能、抗菌药物作用靶点挖掘，可向全球科研人员共享使用。
关键词
变形链球菌；CRISPRi；阵列突变文库；必需基因；高通量表型筛选；生物膜；抗菌靶点；基因抑制；致龋菌
研究目的
1 构建变形链球菌专用阵列化CRISPRi（SNAP）文库，实现250余个必需基因可控可逆抑制。
2 验证SNAP文库在富培养基、木糖诱导培养基下的菌株生长表型稳定性。
3 利用文库高通量筛选必需基因对蔗糖依赖生物膜形成的调控作用。
4 筛选氟化钠、西吡氯铵两类口腔抗菌药物的作用靶标必需基因，阐明药物抑菌机制。
5 建立可批量复制、共享的变形链球菌功能基因组研究工具，完善革兰氏阳性菌CRISPRi筛选体系。
研究思路
1 文库菌株构建：基于前期Tn-seq筛选的必需基因，设计靶向各基因sgRNA质粒，转化携带Pxyl-dcas9的Δcas9变形链球菌UA159菌株，构建单基因抑制菌株。
2 阵列保藏：将全部270株（含对照）菌株分装三块96孔甘油保藏板，设置无sgRNA、gtfB、scrB三类对照菌株，低温储存，复制针扩增文库复制品。
3 基础生长验证：分别在BHI富培养基、添加0.1%木糖限定培养基培养，酶标仪测定OD600，计算生长曲线AUC值判定生长缺陷；Bioscreen测定药物亚抑菌浓度。
4 生物膜筛选：含葡萄糖、蔗糖限定培养基添加梯度木糖，结晶紫染色定量生物膜积累量，分析必需基因抑制对生物膜的双向调控作用。
5 抗菌药物靶点筛选：分别添加亚抑菌浓度氟化钠、西吡氯铵培养文库菌株，对比各组AUC差异，筛选药物敏感突变株。
6 靶点回补验证：对CPC敏感的细胞壁、脂质合成相关CRISPRi菌株重新构建，重复生长实验验证表型重复性。
7 综合生长、生物膜、药敏全部表型数据，证明SNAP文库高通量筛选实用性。
研究亮点
1 全球首套变形链球菌阵列化CRISPRi必需基因文库，填补致龋菌必需基因高通量筛选工具空白，可稳定共享扩增。
2 木糖诱导型Pxyl调控系统可实现0~95%梯度基因抑制，无诱导时本底弱抑制不影响基础生长，诱导后可显著凸显必需基因缺失表型。
3 首次高通量证实必需基因抑制对生物膜存在双向调控：57%菌株生物膜下降、21%菌株生物膜上升，揭示必需基因参与生物膜复杂调控网络。
4 利用文库明确西吡氯铵靶向细菌细胞壁、脂质合成通路必需基因，氟化钠在实验浓度下无特异性敏感必需基因，解析两种口腔杀菌剂差异化作用机制。
5 建立标准化革兰氏阳性菌CRISPRi阵列文库构建、复制、高通量表型筛选完整流程，可推广至其他链球菌。
可延伸的方向
1 利用SNAP文库筛选新型防龋小分子化合物的作用分子靶点，解析抑菌机理。
2 基于文库筛选致龋、宿主定植相关必需基因，开发新型抗龋抗菌靶点。
3 多基因联合CRISPRi抑制，研究必需基因通路之间遗传互作。
4 在不同碳源、氧化、酸性口腔模拟环境下开展文库全基因组表型筛选。
5 改造文库诱导启动子，构建可精准时序调控基因抑制的升级版CRISPRi工具。
测量的数据及研究意义
1 不同培养基下文库菌株生长AUC统计散点图（图1），富培养基无木糖时全部菌株无显著生长缺陷，证明Pxyl无诱导本底抑制不干扰基础生理，木糖诱导条件下141株菌株出现生长受损，验证文库靶向必需基因抑制功能可靠。
2 梯度木糖下对照菌株生物膜定量、全文库生物膜-生长关联散点图（图2），gtfB抑制后生物膜随木糖浓度升高显著降低，验证文库可精准筛选生物膜关键基因，必需基因抑制对生物存在促进、抑制两种效应，证明基础代谢基因广泛调控致龋生物膜形成。
3 氟化钠、西吡氯铵处理菌株生长缺陷散点图（图3），125 μg/mL氟化钠处理无特异性敏感菌株，该浓度下氟化作用不依赖单一必需基因，0.25 μg/mL西吡氯铵筛选出murE、fabK等10个细胞壁/脂质合成敏感必需基因，明确药物作用靶点。
4 CPC敏感单菌株生长动力学曲线（图4），单独抑制细胞壁、脂质合成基因后菌株在CPC环境下生长大幅受阻，重复实验验证筛选结果真实可靠，直接证明CPC通过破坏细菌包膜结构实现杀菌。
5 Bioscreen测定药物亚抑菌浓度生长曲线，批量梯度测试氟化钠、CPC，精准确定后续高通量筛选使用的亚抑菌浓度，为文库药敏筛选提供标准化药物处理条件，保证筛选结果可比性。
6 GFP荧光定量本底抑制数据，无木糖时基因仅20%弱抑制，木糖诱导抑制可达95%，证明诱导系统可控梯度抑制。
结论
1 本研究构建SNAP阵列CRISPRi文库，包含270株变形链球菌菌株，可木糖诱导可逆抑制250余个必需基因，文库可使用复制针快速批量扩增，便于科研共享。
2 无木糖诱导时菌株基础生长不受影响；添加木糖触发强基因抑制，大量必需基因缺失菌株出现增殖缺陷，文库表型稳定可重复。
3 必需基因抑制对蔗糖型致龋生物膜存在双向调控效应，超过半数菌株生物膜合成降低，部分菌株生物膜反而提升，说明基础代谢网络调控生物膜进程复杂。
4 亚抑菌浓度氟化钠不会特异性依赖单一必需基因发挥抑菌作用；西吡氯铵靶向细菌细胞壁、脂质合成相关必需基因，破坏细胞膜完整性实现杀菌。
5 SNAP阵列CRISPRi文库是变形链球菌高通量功能基因组可靠工具，可用于生物膜调控、抗菌药物靶点、必需基因生理功能大规模筛选。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用芬兰Bioscreen C Pro全自动微生物生长分析仪完成氟化钠、西吡氯铵浓度梯度预实验，多孔板同步批量测定多药物梯度菌株生长曲线，全程自动定时采集OD600，无需人工多次取样稀释涂布，大幅降低人力与操作误差。
2 仪器可连续记录完整生长周期动态OD变化，精准区分不同药物浓度对变形链球菌生长的抑制强弱，快速筛选出适合高通量文库筛选的亚抑菌工作浓度，避免浓度过高导致全部菌株死亡、浓度过低无筛选差异。
3 标准化统一培养基、接种量、孵育温度振荡条件，全部浓度梯度实验组平行对照，数据统计学稳定，为后续96孔酶标仪大规模文库筛选提供统一实验基准。
4 预实验Bioscreen生长数据与文库高通量AUC筛选结果相互印证，形成浓度预实验-全文库筛选完整实验证据链，保障药敏表型结论严谨。
5 高通量批量检测模式一次性完成数十个药物浓度梯度测试，大幅缩短前期条件摸索周期，提升整体文库构建与验证实验效率。