An experimental target-based platform in yeast for screening Plasmodium vivax deoxyhypusine inhibitors
用于筛选间日疟原虫脱氧次黄嘌呤合酶抑制剂的酵母靶向实验平台
来源：PLOS Neglected Tropical Diseases, Volume 18, Article ID e0012690, 2024, DOI:10.1371/journal.pntd.0012690
《被忽视热带病公共科学图书馆》第18卷，文章编号e0012690，2024年，DOI：10.1371/journal.pntd.0012690
摘要
脱氧次黄嘌呤合酶（DHS）负责真核翻译起始因子eIF5A的关键翻译后修饰，该酶对真核生物存活不可或缺，是理想抗感染药物靶点。但间日疟原虫体外连续培养体系缺失，限制靶向PvDHS药物筛选。本研究利用CRISPR-Cas9改造酿酒酵母，构建双互补筛选平台：敲除酵母内源DYS1基因，基因组整合人HsDHS或间日疟原虫PvDHS，同时敲除多药外排基因、整合荧光标记提升检测灵敏度。该体系对已知人DHS抑制剂GC7敏感度提升60倍。先对ChEMBL-NTD数据库分子进行分子对接虚拟筛选得到9个候选物；再利用自动化高通量设备结合Bioscreen仪器筛选Pathogen Box库400种化合物。酵母生长表型与Western印迹证实N2、N7、PB1三种分子可选择性抑制PvDHS，特异性降低eIF5A次黄嘌呤修饰，对人源DHS无明显抑制。体外疟原虫实验显示三者对氯敏感、耐药恶性疟原虫均有抑制活性，N7活性达纳摩尔级别，且对人肝细胞、乳腺癌细胞低毒。本研究建立无需疟原虫活体的酵母替代筛选平台，可高效筛选疟原虫选择性DHS抑制剂，为新型抗疟先导化合物开发提供工具。
关键词
间日疟原虫；脱氧次黄嘌呤合酶；DHS；酿酒酵母替代筛选；CRISPR基因编辑；分子对接；高通量药物筛选；抗疟先导化合物；次黄嘌呤修饰；药物选择性
研究目的
1 构建基因组稳定整合PvDHS/HsDHS的基因工程酿酒酵母筛选平台，通过敲除药物外排基因、插入荧光标签提升小分子检测灵敏度。
2 验证该酵母平台对DHS抑制剂GC7的检测灵敏度提升幅度，建立标准化筛选实验条件。
3 结合分子对接虚拟筛选与自动化高通量生长筛选，挖掘选择性靶向PvDHS小分子抑制剂。
4 通过Western印迹验证候选化合物对eIF5A次黄嘌呤修饰的选择性抑制作用。
5 评估阳性化合物体外抗疟活性与人体细胞毒性，确认先导分子成药潜力。
6 建立可通用的寄生虫靶标酵母替代高通量筛选技术体系。
研究思路
1 酵母工程菌株构建：CRISPR-Cas9介导同源重组，敲除酿酒酵母内源DYS1、多药调控基因PDR1/PDR3、转运基因SNQ2；CAN1位点整合mCherry/Sapphire荧光报告；DYS位点分别整合MET3启动调控的HsDHS、PvDHS基因，构建SFS04（人源）、SFS05（疟原虫）菌株。
2 平台验证实验：梯度甲硫氨酸调控DHS表达，Bioscreen仪器测定GC7处理后三株酵母生长曲线，计算生长曲线下面积AUC，确定平衡两种菌株eIF5A修饰的培养条件。
3 虚拟分子筛选：同源建模构建PvDHS三维结构，ChEMBL-NTD数据库分子分别对接正构、别构位点，根据结合能筛选9个候选分子。
4 自动化高通量筛选：Eve机器人平台结合Bioscreen连续测OD/荧光，分别测试虚拟9分子、Pathogen Box 400种化合物，对比三株酵母生长差异，筛选仅抑制PvDHS菌株的小分子。
5 分子机制验证：不同浓度候选物处理酵母，Western印迹检测eIF5A次黄嘌呤修饰水平，验证靶标选择性。
6 体外药效与毒性：培养3D7、Dd2恶性疟原虫测定EC50；MCF7、HepG2细胞检测化合物细胞IC50。
7 综合结构、酵母、寄生虫、细胞数据，评估平台应用价值与先导分子开发前景。
研究亮点
1 首创高灵敏酿酒酵母替代筛选平台，多重基因改造后对DHS抑制剂敏感度提升60倍，解决间日疟原虫无法体外持续培养的筛选瓶颈。
2 实现双重对照同步筛选，同一体系区分化合物对疟原虫/人源DHS选择性，快速剔除人体毒性候选物。
3 联合虚拟分子对接与全自动高通量生长筛选，一次性获得3个高选择性PvDHS抑制剂，N7纳摩尔抗疟活性优于现有多数先导物。
4 证实候选分子仅抑制疟原虫eIF5A修饰，不影响人源同源蛋白，低细胞毒，具备安全抗疟药物开发潜力。
5 整套CRISPR改造+Bioscreen高通量检测流程可推广至其他寄生虫酶靶点药物筛选。
可延伸的方向
1 优化N2、N7、PB1分子结构，合成衍生物提升结合亲和力与疟原虫抑制活性。
2 动物体内药效实验，评估化合物口服吸收、体内抗疟与脏器毒性。
3 拓展该酵母平台用于弓形虫、利什曼原虫等其他寄生虫DHS抑制剂筛选。
4 改造酵母启动子实现DHS精准梯度表达，开发更高通量药物剂量梯度筛选方案。
5 解析PvDHS与N7复合物晶体，明确别构抑制分子作用机理。
测量的数据及研究意义
1 PvDHS同源建模与分子对接结合能数据（表1），搭建可靠PvDHS三维模型，区分正构、别构两个配体结合区域，根据对接自由能筛选9个高亲和力虚拟候选分子，缩小实体筛选范围，降低实验成本。
2 Bioscreen仪器连续监测酵母生长AUC定量数据（图2、图3、图4），动态记录72h全周期OD与荧光信号，精准量化化合物对三株酵母生长差异，快速区分广谱抑制剂与疟原虫选择性抑制剂，高通量完成数百种化合物初筛。
3 酵母eIF5A次黄修饰Western定量数据（图5），N2、N7、PB1仅显著降低PvDHS菌株修饰水平，人源菌株无明显变化，从蛋白修饰层面直接证明化合物靶标选择性，排除非特异性生长抑制干扰。
4 恶性疟原虫体外半数抑制EC50数据（表2），N7对氯喹耐药Dd株EC50达纳摩尔级，活性最优；N2、PB为微摩尔活性，确认三类化合物真实抗寄生虫药效，不只是酵母体外表型假象。
5 人肝癌、乳腺癌细胞存活率IC50数据，N2、PB无明显人体细胞毒性，N7仅中等细胞抑制，证明先导分子对人体正常细胞安全性高，具备后续成药基础。
6 平台验证GC7梯度生长曲线（图2），改造后菌株对抑制剂敏感度提升60倍，低浓度即可观测生长差异，证明多重基因编辑改造显著优化筛选平台检测下限。
结论
1 本研究通过CRISPR基因编辑构建特殊酿酒酵母筛选菌株，敲除多药转运基因、插入荧光标记、置换内源DHS为人/疟原虫同源酶，构建的替代筛选平台对DHS抑制剂敏感度提升60倍，无需活体疟原虫即可高通量筛选靶向抑制剂。
2 虚拟分子对接结合Bioscreen自动化高通量筛选，得到N2、N7、PB1三种选择性PvDHS抑制剂，三者可特异性降低疟原虫eIF5A次黄嘌呤修饰，不干扰人源DHS功能。
3 体外疟原虫培养实验证实三种化合物对氯敏感、氯耐药恶性疟原虫均有抑制活性，N7抑制活性最优；且对人肿瘤细胞毒性极低，具备安全抗疟先导化合物潜力。
4 该酵母筛选平台通用性强，可拓展至其他寄生虫同源酶靶点的小分子抑制剂高通量筛选，为抗寄生虫新药研发提供低成本体外筛选工具。
5 N2作用于PvDHS正构位点，N7结合别构口袋，两种不同抑制模式为后续药物结构优化提供双重改造思路。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用芬兰Bioscreen C全自动微生物多孔检测仪配套Eve自动化工作站，96/384孔同步平行多组化合物浓度梯度，30℃恒温持续振荡，每20分钟自动采集OD600与荧光信号，72h无间断监测，无需人工分次取样，大幅减少人为操作带来的读数误差与人力消耗。
2 仪器完整记录延滞期、对数、稳定全生长周期动态变化，输出曲线下面积AUC作为定量指标，单点终点OD无法区分弱选择性化合物带来的细微生长差异，精准量化各分子选择性强弱。
3 所有酵母菌株、培养基、甲硫氨酸调控浓度、化合物溶剂体系完全标准化，三株对照菌株同步同板检测，消除板间误差，保证选择性对比数据统计学可靠。
4 Bioscreen高通量时序生长数据作为核心初筛证据，与Western蛋白修饰、疟原虫药效、人体细胞毒性多层实验形成完整证据链，严谨区分真正靶标特异性抑制剂与非特异性细胞毒分子。
5 单轮实验可一次性完成数百种化合物梯度平行筛选，大幅缩短先导分子初筛周期，相比传统摇瓶单点检测效率提升数十倍。