The role of glnR gene in heat and oxidative stress cross-adaptation in Lacticaseibacillus rhamnosus
glnR基因在鼠李糖乳杆菌热与氧化应激交叉适应中的作用
来源：LWT - Food Science and Technology, Volume 201, Article ID 116278, 2024, DOI:10.1016/j.lwt.2024.116278
《LWT-食品科学与技术》第201卷，文章编号116278，2024年，DOI：10.1016/j.lwt.2024.116278
摘要
热、氧化胁迫是喷雾干燥过程造成乳酸菌活菌大量损失的核心因素，前期研究发现鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301存在热-氧化交叉适应（H-OCA）现象，低氮环境可提升菌株双重胁迫耐受，但介导该交叉适应的核心调控基因尚不明确。本研究无痕敲除全局氮调控基因gln获得突变株glnRm，结合Bioscreen生长测定、多重胁迫存活实验、多组转录组测序开展验证。结果显示：野生株受热、氧化预处理后交叉适应能力显著提升；gln缺失突变株热预处理抗热（HPH）、热预处理抗氧化（HPO）交叉适应能力大幅减弱，但氧化预处理抗氧化（OPO）能力无明显变化。转录组数据表明，野生株遭受两类胁迫时会同步下调大量氨基酸转运、代谢基因；gln敲除后该下调效应基本消失，gln是介导氮代谢重编程、串联热与氧化应激响应的核心枢纽。喷雾干燥实验证实gln缺失菌株预处理无法提升干燥存活率，说明gln是乳酸菌加工胁迫耐受的关键调控元件，为提升益生菌制剂存活率提供新靶点。
关键词
鼠李糖乳杆菌；gln；氮代谢；热胁迫；氧化胁迫；交叉适应；转录组；喷雾干燥；氨基酸转运；益生菌胁迫耐受
研究目的
1 构建鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301 gln无痕敲除突变株glnRm，验证gln基因缺失对菌株基础生长特性的影响。
2 对比野生株与突变株在酸、冷、热、氧化单一胁迫下的存活差异，明确gln对基础胁迫耐受的作用。
3 系统检测两菌株热-氧化四种交叉适应（HPH/OPH/HPO/OPO）能力，确定gln是否调控交叉适应表型。
4 开展无胁迫、热预处理、氧化预处理三组转录组测序，解析gln缺失引发的全局转录重塑规律，筛选氮代谢相关差异基因。
5 模拟工业喷雾干燥工艺，验证gln基因对干燥胁迫及预处理保护效果的调控作用，挖掘益生菌改良靶点。
研究思路
1 基因敲除载体构建：扩增gln上下游同源片段，改造pUC19e自杀质粒，电转化野生株，双交换同源重组获得无标记glnRm突变，PCR鉴定基因型。
2 基础生长测定：设置无胰蛋白胨、标准、高胰蛋白�、谷氨酰胺四种MRS培养基，采用芬兰Bioscreen仪器连续记录两菌株24h生长曲线。
3 单一胁迫耐受检测：分别进行酸、低温、高温、过氧化氢氧化处理，计数活菌存活率。
4 交叉适应表型测定：设置46℃热预处理、0.5mM H₂O₂氧化预处理，再分别施加高温、氧化致死胁迫，统计各组存活比例。
5 转录组测序：野生与突变株分空白、热预处理、氧化预处理三组建库测序，PCA、差异基因、KEGG富集、DRC去抑制系数分析。
6 喷雾干燥模拟实验：菌体经预处理后喷雾干燥，测定干燥后活菌留存率。
7 整合生长、胁迫、转录、干燥数据，构建gln调控热-氧化交叉适应分子模型。
研究亮点
1 首次证实gln全局氮调控基因是串联鼠李糖乳杆菌热、氧化应激交叉适应的核心枢纽，填补乳酸菌交叉适应调控通路空白。
2 明确gln功能具有特异性：仅调控HPH、HPO交叉适应，不影响OPO氧化预适应通路，两类胁迫存在部分独立调控网络。
3 分子机制层面阐明：热、氧化胁迫下野生株依靠gln下调氨基酸转运与合成通路，减少胞内氮源积累降低氧化损伤；gln缺失后该保护转录程序失效。
4 工业应用层面验证gln直接决定喷雾干燥预处理保护效果，是提升益生菌干粉存活率关键改良基因。
5 构建完整菌株构建-高通量生长-多重胁迫-转录组-加工模拟验证研究范式，可为其他益生菌胁迫机制研究提供参考。
可延伸的方向
1 过表达gln基因回补突变株，直接验证该基因对交叉适应的功能必要性。
2 定点突变GlnR蛋白DNA结合结构域，解析蛋白结合靶启动子的分子互作机制。
3 基于gln调控通路优化益生菌发酵氮源配方，提升工业喷雾干燥存活率。
4 在植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌等其他益生菌中验证gln调控交叉适应保守性。
5 构建gln组成型高表达工程菌株，开发高耐加工特性益生菌发酵菌种。
测量的数据及研究意义
1 四种氮源培养基Bioscreen生长动力学OD曲线（图1c-f），标准与无胰蛋白胨培养基中glnRm生长速率略低于野生株，高谷氨酰胺、高氮培养基两株生长无差异，证明gln仅在低氮环境调控菌体生长，高氮条件下该调控通路无明显作用。
2 单一胁迫活菌存活率柱状数据（图4a），gln缺失仅显著降低菌株酸胁迫耐受，冷、热、氧化单一直接耐受无显著改变，说明gln不参与基础急性胁迫应答，仅介导预处理诱导的交叉适应长效保护。
3 转录组PCA、差异基因火山、KEGG富集数据（图2、图3），热、氧化预处理下野生株大量氨基酸转运、代谢基因显著下调，glnRm中该抑制效应几乎消失，定义DRC去抑制系数，量化gln对氮代谢基因的转录抑制强度，筛选gln直接靶向操纵子（glnQHMP、dppEBCDF等）。
4 四种交叉适应存活率统计数据（图4b、4c，图5a、5b），glnRm的HPH、HPO交叉适应存活率显著下降，OPO适应能力不受影响，区分两类交叉适应独立调控通路，证明GlnR专属于热介导的交叉适应调控模块。
5 喷雾干燥活菌留存率数据（图5c），野生株经热/氧化预处理后干燥存活率大幅提升，glnRm预处理无保护效果，从工业加工层面证明gln是益生菌耐干燥性能关键调控基因。
6 氮代谢调控通路机制图（图6），整合差异基因构建GlnR介导氮重编程-胁迫耐受分子通路，直观解释低氮、GlnR下调氨基酸积累减轻氧化损伤的内在逻辑。
结论
1 无痕同源重组成功构建鼠李糖乳杆菌gln基因缺失突变株glnRm，低氮培养基中突变株生长存在轻微缺陷，高氮环境生长不受影响。
2 gln基因不调控菌株直接高温、氧化、低温急性胁迫耐受，但为热诱导的热、氧化交叉适应（HPH、HPO）必需基因，氧化预处理抗氧化通路不依赖gln。
3 热、氧化预处理时野生株依靠GlnR全局抑制氨基酸转运、合成相关操纵子，减少胞内游离氨基酸积累以缓解氧化损伤；gln敲除后该转录抑制程序丧失，交叉适应能力衰退。
4 喷雾干燥模拟实验证实，缺失gln的菌株无法通过热或氧化预处理获得干燥保护效果，该基因是提升益生菌工业加工存活率的核心靶点。
5 氮代谢重编程是乳酸菌热-氧化交叉适应核心机制，gln作为氮调控枢纽连接营养代谢与多重胁迫应答，为高抗性益生菌菌种改造提供理论支撑。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用芬兰Bioscreen全自动微生物生长分析仪，四种不同氮源培养基同步设置野生、突变株平行组，全程24h每小时自动采集OD600，无需人工定时取样稀释测浊，大幅降低人为操作带来的读数误差与实验工作量。
2 仪器完整记录延滞、对数、稳定全生长周期动态变化，精准量化不同氮源条件下两菌株生长速率细微差异，仅终点单点OD无法区分低氮环境下的生长缺陷。
3 所有培养基配方、接种初始OD、37℃恒温振荡条件完全标准化，各组数据统计学平行度高，直观判定gln调控生长依赖环境氮浓度高低。
4 Bioscreen基础生长表型作为前置生理证据，与多重胁迫存活、转录组分子、喷雾干燥工业数据形成完整证据链，保证gln调控交叉适应机制推导严谨可靠。
5 高通量多孔并行检测模式一次性完成四种氮源梯度生长筛选，无需分多批次摇瓶重复培养，大幅缩短菌株基础生理特性初筛周期。