Disruptions of rpiAB Genes Encoding Ribose-5-Phosphate Isomerases in E. coli Increases Sensitivity of Bacteria
编码核糖-5-磷酸异构酶的rpiAB基因失活提升大肠杆菌对抗生素的敏感性
来源：Cells, Volume 13, Article ID 1915, 2024, DOI:10.3390/cells13221915
《细胞》第13卷，文章编号1915，2024年，DOI：10.3390/cells13221915
摘要
核糖-5-磷酸异构酶RpiA、RpiB是大肠杆菌戊糖磷酸途径（PPP）戊糖互变核心酶。本研究发现同时敲除rpiAB会阻断氧化支路生成核糖-5-磷酸（R5P），引发胞内NADPH、谷胱甘肽、ATP含量大幅下降，造成胞内氧化还原与能量失衡，但不会激活soxRS氧化应激通路，反而使细菌对多种抗生素、氧化剂（百草枯、过氧化氢）高度敏感。rpiAB缺失株转酮醇酶Tkt活性显著上升；外源核糖会强烈抑制该突变株生长，木糖无此效应。敲除核苷分解基因deoB或过表达gmhA增加庚糖-7-磷酸消耗，均可解除rpiAB缺失带来的抗生素高敏感表型。研究证实rpiAB缺失导致R5单向合成是细菌抗生素超敏感的核心诱因，戊糖磷酸途径可作为新型抗菌药物开发靶点。
关键词
戊糖磷酸途径；核糖-5-磷酸异构酶；rpiAB；核糖-5-磷酸；大肠杆菌；抗生素敏感性；氧化还原稳态；转酮醇酶；核苷代谢
研究目的
1 探究rpiA、rpiB双基因缺失对大肠杆菌抗生素敏感性的影响，对比rpe单缺失菌株表型差异。
2 解析rpiAB敲除后胞内NADPH、谷胱甘肽、ATP氧化还原与能量代谢变化规律。
3 明确rpiAB缺失对soxRS氧化应激通路、转酮醇酶活性的调控作用。
4 阐明外源核糖对rpiAB突变株生长抑制机制，挖掘逆转抗生素敏感的遗传改造方案。
5 揭示R5P单向合成介导细菌抗生素高敏感分子机制，为抗菌靶点开发提供理论依据。
研究思路
1 菌株构建：利用P1转导获得ΔrpiAB、Δrpe、Δzwf、Δdeo、Ptet-gmhA等单/多突变菌株，PCR验证基因敲除；构建pSoxS::lux氧化应激报告菌株。
2 生长曲线测定：采用芬兰Bioscreen C全自动微生物分析仪，监测野生型与各突变株正常、添加核糖/木糖条件下OD600生长动力学。
3 抗生素与氧化剂药敏实验：平板稀释菌落计数、液体杀菌实验测定各菌株对喹诺酮、氨基糖苷、利福平等抗生素及过氧化氢、百草枯的存活能力。
4 胞内代谢物定量：试剂盒检测各组NADPH、总谷胱甘肽（GSH/GSSG）、ATP相对含量。
5 氧化应激通路检测：lux荧光报告系统定量soxS启动子激活水平，以Δzwf为阳性对照。
6 酶活检测：试剂盒测定野生株与突变株转酮醇酶T活性。
7 回补验证：分别敲除deo、过表达gmhA，观察是否恢复rpiAB缺失株抗生素耐受与核糖抗性。
8 整合代谢、表型数据，建立R5P代谢失衡调控细菌抗生素敏感性分子模型。
研究亮点
1 首次证实同时敲除rpiAB会让大肠杆菌广谱抗生素超敏感，仅敲除rpe无明显药敏变化，区分两种戊糖异构酶的功能差异。
2 发现rpiAB缺失造成氧化还原、能量双重失衡，但不会激活经典soxRS抗氧化通路，是全新代谢应激表型。
3 明确转酮醇酶活性大幅升高是rpiAB缺失后戊糖磷酸途径逆向代偿核心特征，外源核糖特异性抑制突变株增殖。
4 提供两种可逆转抗生素高敏感的遗传策略：阻断核苷来源R5P、提升庚糖中间产物消耗，直接证明R5P单向积累是致敏根源。
5 提出戊糖磷酸途径核糖代谢酶可作为新型抗菌增效靶点，为克服细菌耐药提供新思路。
可延伸的方向
1 筛选靶向RpiA/RpiB小分子抑制剂，体外、动物模型验证其抗生素增敏效果。
2 开展13C代谢流分析，精准定量rpiAB缺失后戊糖磷酸途径各支路流量变化。
3 在多重耐药致病菌（沙门氏菌、克雷伯菌）中验证rpi同源基因缺失的药敏效应。
4 解析RpiA、RpiB蛋白晶体结构，设计特异性酶抑制剂。
5 探究临床抗生素处理后致病菌rpi基因表达变化，评估体内代谢靶向抗菌潜力。
测量的数据及研究意义
1 Bioscreen仪器测定各菌株生长曲线OD时序数据（图5a、图5c、图6c），直观显示ΔrpiAB菌株生长速率显著慢于野生型与Δrpe株；外源核糖仅抑制rpiAB突变株生长，木糖无抑制作用，直观证明Δdeo、gmhA过表达可恢复突变株在核糖环境下的生长能力，验证R5P过量是生长抑制诱因。
2 抗生素处理后细菌菌落存活定量数据（图2），定量证明ΔrpiAB对喹诺酮、氨基糖苷、红霉素、利福平全部高度敏感，Δrpe药敏仅轻微下降，直接说明R5P代谢失衡会广谱放大各类抗生素杀菌作用。
3 胞内NADPH、谷胱甘肽、ATP定量柱状图数据（图3），rpiAB缺失株还原力NADPH、还原性谷胱甘肽、总ATP均显著降低，氧化还原失衡、能量匮乏，解释突变株抗氧化、抗药物能力下降的代谢底层原因。
4 soxS荧光报告氧化应激检测数据（图4a）， ΔrpiAB氧化还原失衡但未激活soxRS通路，区别于zwf缺失经典氧化应激模型，说明该菌株代谢缺陷属于独特应激类型，不依赖常规抗氧化通路。
5 过氧化氢、百草枯氧化剂存活数据（图4b），rpiAB缺失株对氧化剂存活率与野生株无显著差异，证明其抗生素敏感机制和普通氧化损伤通路相互独立。
6 转酮醇酶Tkt活性定量数据（图5b），ΔrpiAB菌株Tkt活性提升3倍以上，Δrpe酶活显著降低，阐明rpiAB缺失后戊糖磷酸途径逆向代偿代谢模式。
7 deo敲除、gmhA过表达回补药敏实验数据（图6a、图6b），阻断核苷生成R5P或消耗S7P中间产物均可恢复细菌抗生素耐受，直接证明R5P单向大量合成是rpiAB缺失致敏的核心分子机制。
结论
1 rpiA与rpiB双基因缺失会阻断戊糖磷酸氧化支路生成R5P，迫使非氧化支路逆向运转，转酮醇酶活性大幅上升，引发胞内NADPH、谷胱甘肽、ATP匮乏，造成能量与氧化还原双重失衡。
2 rpiAB缺失大肠杆菌对喹诺酮、氨基糖苷、大环内酯、利福平等多种抗生素高度敏感，但不会激活soxRS氧化应激通路，对过氧化氢、百草枯氧化剂耐受性无明显改变。
3 外源核糖会大量生成R5P，特异性抑制ΔrpiAB菌株增殖，木糖无该抑制效应；敲除deo阻断核苷来源R5P或过表达gmhA消耗庚糖中间物，均可解除抗生素超敏感表型。
4 R5P单向不可逆累积是rpiAB缺失株抗生素超敏感的根本原因，核糖代谢稳态直接决定细菌抗生素耐受水平。
5 戊糖磷酸途径核糖-5-磷酸异构酶可作为新型抗菌增效靶点，靶向抑制RpiAB能够提升现有抗生素杀菌效率。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长分析仪，多孔板同步平行设置野生株、各类突变株、添加核糖/木糖多组，37℃恒温持续振荡，全程自动定时采集OD600，无需人工分次取样测OD，极大减少人工操作带来的读数误差与实验工作量。
2 仪器连续记录数十小时完整生长周期，清晰区分延滞期、对数期、稳定期，精准量化各菌株生长速率差异，单点终点OD无法区分核糖带来的细微生长抑制效应。
3 所有实验组培养基、接种初始OD、培养温度振荡条件完全标准化，数据统计学可比性强，可直观对比ΔrpiAB、Δrpe、回补菌株三类生长表型差异。
4 生长曲线表型与胞内代谢、药敏分子实验形成完整证据链，从宏观生长层面佐证R5P过量会抑制细菌增殖，支撑抗生素致敏分子机制结论。
5 高通量批量检测可一次性完成多突变体、碳源梯度平行生长测定，快速完成菌株生长表型初筛，大幅缩短前期条件摸索实验周期。