Expanded genome and proteome reallocation in a novel, robust Bacillus coagulans strain capable of utilizing pentose and hexose sugars
一种可利用戊糖与己糖的新型强耐受凝结芽孢杆菌菌株的拓展基因组与蛋白质组重分配研究
来源：mSystems, November 2024, Volume 9, Issue 11, Article DOI:10.1128/msystems.00952-24
《mSystems》2024年11月第9卷第11期，DOI：10.1128/msystems.00952-24
摘要
本研究分离获得工业潜力优良的新型凝结芽孢杆菌B-768，该菌株可高效利用木质纤维素水解液中的戊糖、己糖，具备高发酵耐受性。全基因组测序显示其基因组全长3.94 Mbp，远高于已报道凝结芽孢杆菌平均基因组，碳水化合物代谢、可移动元件相关基因大量扩增。表型实验证实该菌可在宽温度区间生长，耐受高乳酸，且能直接利用未脱毒柳枝稷水解液发酵产乳酸。葡萄糖、木糖单独培养的定量蛋白质组存在显著差异：葡萄糖培养时菌体将更多蛋白资源分配至糖酵解通路，产生乳酸溢流；木糖摄取耗能更高，菌体重分配蛋白质组，上调三羧酸、丙酮酸代谢以供给能量，乳酸产量大幅下降。混合糖培养存在葡萄糖效应（碳分解物阻遏），葡萄糖优先消耗抑制木糖代谢。基因组注释显示菌株拥有完整多样的五碳/六碳糖转运、分解基因，同时配备完善限制修饰、CRISPR-Cas噬菌体防御系统，提升发酵稳定性。本研究从基因组、蛋白质组、生理表型多维度解析B-768强耐受、广谱碳源利用的分子基础，为木质纤维素生物制造提供优质底盘菌株。
关键词
凝结芽孢杆菌；戊糖；己糖；木质纤维素水解液；乳酸发酵；基因组；蛋白质组重分配；碳分解物阻遏；微生物耐受性；生物炼制
研究目的
1 表征新型凝结芽孢杆菌B-768生理发酵特性，明确其碳源利用谱、温度适应性与产物耐受能力。
2 完成B-768高质量基因组组装与功能注释，对比模式菌株解析基因组扩增区域的功能贡献。
3 揭示葡萄糖、木糖两种碳源下菌体蛋白质组重分配规律，解释乳酸溢流表型的分子机制。
4 阐明菌株耐受未脱毒生物质水解液的分子响应特征，挖掘抗抑制相关蛋白靶点。
5 解析该菌株碳分解物阻遏机制，为解除葡萄糖对戊糖代谢抑制提供理论依据。
研究思路
1 菌株生理高通量筛选：采用芬兰Bioscreen Pro仪器，测定不同碳源、温度、乳酸浓度下生长曲线，明确基础发酵表型。
2 基因组测序与比较基因组：PacBio平台完成完整基因组组装，开展泛基因组、COG功能、原噬菌体、CRISPR、限制修饰系统注释，与36D1、DSM1菌株对比。
3 碳源单糖发酵实验：分别以葡萄糖、木糖、混合糖、柳枝稷水解液为碳源，摇瓶与控pH发酵，检测菌体量、残糖、乳酸产量。
4 定量蛋白质组分析：取对数期菌体进行LC-MS/MS，主成分、差异蛋白、COG蛋白质量分数统计，对比糖代谢、能量通路蛋白表达。
5 水解液胁迫蛋白组：对比混合精制糖与未脱毒水解液蛋白差异，筛选抗毒性关键蛋白。
6 整合基因组、蛋白组、生理数据，构建碳代谢与胁迫耐受调控模型。
研究亮点
1 获得目前基因组最大的凝结芽孢杆菌B-768，碳水代谢、可移动元件基因大幅扩增，赋予广谱糖利用能力。
2 首次通过定量蛋白质组阐明糖源驱动蛋白组重分配：葡萄糖偏向糖酵解乳酸溢流，木糖上调TCA供能、降低乳酸合成。
3 该菌株可直接利用含多种抑制物的粗柳枝稷水解液，发酵效率无明显下降，工业应用价值突出。
4 完整解析菌株CRISPR、多套限制修饰防御系统，降低发酵噬菌体污染风险。
5 系统揭示该菌碳分解物阻遏核心依赖FBP调控CcpA通路，为改造同步利用戊己糖工程菌提供靶点。
可延伸的方向
1 敲除/改造CcpA通路关键基因，弱化碳分解物阻遏，实现葡萄糖、木糖同步共发酵。
2 靶向木糖、阿拉伯糖代谢关键基因过表达，提升水解液戊糖转化效率与乳酸得率。
3 改造甲基乙二醛解毒相关蛋白，进一步强化菌株对水解抑制物的耐受性。
4 基于菌株完整遗传元件，开发高效基因编辑工具，构建产高附加值酯类、有机酸工程菌株。
5 开展5L、50L发酵罐放大实验，验证菌株工业化生产稳定性。
测量的数据及研究意义
1 Bioscreen高通量生长曲线OD时序数据（图1），批量测定多碳源、温度、乳酸梯度生长速率，快速确定菌株最适生长区间与乳酸耐受上限，排除生长差异干扰，直观证明B-768可高效利用全部木质纤维素特征单糖。
2 基因组组装与比较基因组统计数据（表1、图2、图3），量化B-768基因组扩增规模，证明碳水代谢、可移动元件扩增是广谱碳利用的遗传基础，完整注释CRISPR、限制修饰防御系统，解释菌株发酵抗噬菌体优势。
3 单糖发酵动力学数据（图5A、5B），量化葡萄糖、木糖生长速率、糖消耗、乳酸产量差异，直观呈现乳酸溢流现象，为蛋白组差异表型提供生理表型佐证。
4 定量蛋白质组差异、COG蛋白丰度数据（图5C-5L），明确葡萄糖、木糖下细胞蛋白资源分配策略，解释能量代谢通路表达差异，从分子层面阐明不同碳源乳酸合成差异的内在机制。
5 混合糖与水解液发酵、蛋白组数据（图6、表5），证实葡萄糖介导强碳分解物阻遏，水解液诱导大量抗胁迫、糖转运蛋白上调，筛选到甲基乙二醛解毒、趋化、转录调控关键抗逆靶点蛋白。
结论
1 新型凝结芽孢杆菌B-768拥有迄今该物种最大基因组，碳水转运代谢、可移动元件基因显著扩增，具备利用多种戊糖、己糖的遗传基础。
2 碳源类型重塑菌体蛋白质组分配：葡萄糖条件下菌体大量分配蛋白至糖酵解，产生乳酸溢流；木糖摄取耗能更高，细胞上调TCA与丙酮酸代谢供能，乳酸产量显著降低。
3 B-768耐受高乳酸，可直接发酵未脱毒柳枝稷水解液，抑制物不会显著降低生长与乳酸生产能力，适合工业生物炼制。
4 菌株拥有完整CRISPR-Cas与多套限制修饰系统，能抵御噬菌体侵染，提升发酵过程稳定性。
5 该菌碳分解物阻遏由FBP-CcpA通路介导，葡萄糖存在时强烈抑制木糖代谢相关基因，可通过靶向通路改造实现戊己糖同步利用。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用Bioscreen Pro高通量微生物生长分析仪，96孔蜂窝板并行设置温度、碳源、乳酸多梯度实验组，37–55℃区间全自动每5分钟采集OD580，连续监测24–48 h，无需人工分批取样，大幅降低人为操作带来的读数与时间误差。
2 仪器动态连续记录完整延滞期、对数期、稳定期生长全过程，可精准计算比生长速率μ，区分微弱生长差异，单一终点OD检测无法实现动力学定量。
3 标准化统一培养基、接种初始OD、振荡孵育条件，所有实验组具备统一对照基准，数据统计学可比性强，快速筛选菌株最优发酵温度与乳酸耐受极限。
4 高通量批量检测大幅缩短生理表型初筛周期，一次性完成十余种糖源、温度梯度平行实验，快速锁定菌株广谱碳利用特性，为后续发酵罐、蛋白组深度实验提供前置筛选依据。
5 生长曲线数据作为基础生理对照，排除菌株增殖快慢对乳酸产量、蛋白表达的混杂干扰，保证后续代谢、分子实验结论严谨可靠。