全自动生长曲线分析仪

A c-di-GMP binding effector STM0435 modulates flagellar motility and pathogenicity in Salmonella

一种结合c-di-GMP的效应蛋白STM0435调控沙门氏菌鞭毛运动性与致病性

来源：Virulence, Volume 15, Article number 2331265, 2024, DOI:10.1080/21505594.2024.2331265

《毒力》第15卷，文章编号2331265，2024年，DOI：10.1080/21505594.2024.2331265

摘要

鞭毛是鼠伤寒沙门氏菌侵袭宿主、诱导细胞焦亡的关键毒力因子，鞭毛合成调控直接决定细菌致病能力与免疫逃逸水平。本研究鉴定保守未知YajQ家族蛋白STM0435为全新鞭毛调控因子。stm0435基因敲除株（∆stm0435）相比野生株，细胞、动物感染模型中致病性显著上升。转录组与定量蛋白质组联合分析显示，敲除株内全部三类鞭毛编码基因表达大幅上调；表面等离子共振（SPR）体外实验证实STM0435可特异性结合第二信使c-di-GMP，解离常数KD约8.383 μM。本研究解析游离态、c-di-GMP结合态STM0435晶体结构，结构分析表明R33、R137、D138三个氨基酸残基是二者结合必需位点。分别过表达c-di-GMP合成酶STM1987、降解酶STM4264改变胞内c-di-GMP浓度后，细菌运动能力出现显著差异，证明c-di-GMP可增强STM0435对鞭毛合成的抑制作用。本研究在沙门氏菌中新发现c-di-GMP效应蛋白，阐明c-di-GMP-STM0435通路通过调控鞭毛主控基因flhDC影响细菌运动与毒力。

关键词

鼠伤寒沙门氏菌；c-di-GMP；STM0435；YajQ家族蛋白；鞭毛合成；细菌运动；致病性；晶体结构；第二信使

研究目的

1 明确沙门氏菌保守假想蛋白STM0435的生物学功能，验证其是否参与鞭毛与毒力调控。

2 探究STM0435与第二信使c-di-GMP的分子结合作用，定位关键结合氨基酸位点。

3 阐明c-di-GMP介导STM0435调控鞭毛主控基因flhDC的分子通路。

4 在细胞、动物层面验证STM0435对沙门氏菌侵袭、宿主细胞焦亡、体内致死能力的影响。

5 对比YajQ家族不同细菌同源蛋白调控机制，解析该家族蛋白进化保守功能差异。

研究思路

1 生物信息学分析：多物种序列比对，明确STM0435广泛存在于致病γ-变形菌，进化高度保守。

2 基因敲除与回补：利用λRed重组系统构建∆stm0435敲除株，Bioscreen检测野生/敲除株生长曲线，排除生长差异干扰。

3 毒力表型检测：HT29细胞侵袭实验、巨噬细胞LDH细胞毒性实验、BALB/c小鼠体内感染存活实验，评估致病性差异。

4 多组学分析：野生与敲除株转录组、TMT定量蛋白质组联合富集，锁定鞭毛合成通路显著差异基因。

5 运动与生物膜表型：半固体平板观测泳动能力，刚果红平板检测rdar生物膜形态。

6 蛋白体外实验：构建纯化STM0435及位点突变蛋白，SPR测定c-di-GMP结合亲和力。

7 晶体结构解析：游离态、配体结合态蛋白结晶，同步辐射收集衍射数据，解析结合口袋关键残基。

8 胞内c-di-GMP浓度调控：分别过表达合成酶STM1987、降解酶STM4264，观测细菌运动变化，验证c-di-GMP的调控增效作用。

9 整合所有数据构建c-di-GMP-STM0435调控沙门氏菌毒力分子模型。

研究亮点

1 首次在沙门氏菌中鉴定YajQ家族c-di-GMP效应蛋白STM0435，拓展该菌第二信使调控蛋白库。

2 完整解析STM0435游离、结合两种晶体结构，精准定位R33、R137、D138三个c-di-GMP核心结合位点。

3 阐明全新调控通路：c-di-GMP结合激活STM043，抑制鞭毛主控操纵子flhDC转录，下调鞭毛合成、降低细菌致病性。

4 多层次验证表型：体外分子互作+组学筛选+平板表型+细胞感染+动物体内致死实验，证据链完整。

5 发现YajQ家族蛋白存在物种差异化调控机制，黄单胞菌同源蛋白促进毒力，沙门氏菌STM0435抑制鞭毛与致病能力。

可延伸的方向

1 筛选靶向STM0435小分子抑制剂，解除其对鞭毛的抑制，增强沙门氏菌宿主免疫识别。

2 探究STM0435与flhDC转录复合体直接互作分子细节，解析蛋白-DNA结合模式。

3 临床多重耐药沙门氏菌菌株检测stm0435序列突变，关联菌株毒力高低。

4 改造STM0435突变体构建c-di-GMP生物传感探针，用于胞内信使定量检测。

5 探究肠道环境信号如何调控胞内c-di-GMP水平，进而影响STM0435介导的沙门氏菌定植能力。

测量的数据及研究意义

1 Bioscreen全自动生长曲线OD600时序数据（图1a），24小时连续监测野生株与敲除株生长全过程，两组曲线无显著差异，直接证明stm0435敲除不影响细菌基础增殖，后续毒力、运动差异由鞭毛调控而非生长速度导致。

2 HT29细胞侵袭CFU定量、巨噬细胞LDH释放率数据（图1b、图1c），敲除株细胞侵袭能力提升5.3倍，巨噬细胞毒性显著上升，从体外细胞层面证明STM0435负调控沙门氏菌侵袭与细胞焦亡诱导能力。

3 小鼠生存曲线、肝脾细菌定植CFU（图1d、1e、1f），敲除株感染小鼠全部49h内死亡，野生株约73h死亡，脏器载菌量显著更高，体内动物实验证实STM0435可降低沙门氏菌整体致死致病性。

4 转录组-蛋白质组联合火山图、GO富集热图（图2），敲除株I/II/III类全部鞭毛基因显著上调，富集趋化、鞭毛运动通路，组学大数据锁定STM0435核心调控通路，为后续机制实验提供靶标基因。

5 半固体泳动直径、刚果红菌落形态、flhD/fliA/fliC qPCR定量（图3），敲除株运动半径更大、rdar生物膜表型减弱，三类鞭毛主控基因转录显著升高，直观证明STM0435抑制鞭毛合成，反向调控生物膜形成。

6 SPR表面等离子共振结合曲线与KD值（图4、图6b），野生STM0435结合c-di-GMP亲和力KD=8.383 μM，三残基突变后亲和力下降至33.18 μM，体外定量证实R33、R137、D138是配体结合必需关键氨基酸。

7 STM0435晶体结构、配体结合口袋结构图（图5），蛋白分为N、C双保守结构域，各结合一分子c-di-GMP，从原子尺度解释三残基通过氢键网络固定配体，揭示分子识别结构基础。

8 过表达STM1987/STM4264后的细菌泳动直径（图6c、6d、6e、6f），高c-di-GMP下STM0435抑制作用增强，运动显著减弱；降低胞内c-di-GMP则抑制效应消失，证明c-di-GMP作为激活信号放大STM0435的鞭毛抑制功能。

结论

1 沙门氏菌YajQ家族保守蛋白STM0435是全新c-di-GMP特异性效应蛋白，二者依靠R33、R137、D138氨基酸位点稳定结合。

2 STM0435不影响细菌基础生长，但可负向调控鞭毛主控操纵子flhDC转录，抑制全部三类鞭毛基因表达，降低细菌运动能力。

3 stm0435基因缺失会大幅提升沙门氏菌细胞侵袭、巨噬细胞毒性及小鼠体内致死致病性，鞭毛过量表达是毒力升高核心原因。

4 胞内第二信使c-di-GMP可增强STM0435对鞭毛合成的抑制效应，c-di-GMP合成酶、降解酶可反向调控该通路活性。

5 Yaj家族蛋白对细菌毒力调控存在物种差异，黄单胞菌同源蛋白促进致病，沙门氏菌STM0435抑制鞭毛与致病性，为不同致病菌信号通路差异化研究提供依据。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

1 本实验采用Bioscreen C全自动微生物生长分析仪，蜂窝微孔板批量同步检测野生型与stm0435敲除菌株，37℃恒温、每5分钟自动读取OD600，连续监测24h完整生长周期，无需人工间断取样，规避人工操作带来的读数、时间误差。

2 时序生长曲线可完整区分延滞期、对数期、稳定期，直观对比两菌株全程生长速率，明确敲除株与野生株增殖能力无差异，排除“生长更快导致毒力上升”的干扰变量，保证后续鞭毛、致病性表型实验结论严谨可靠。

3 仪器标准化统一培养体系（培养基、稀释倍数、振荡条件），三组生物学平行同步测定，数据重复性、统计学可信度高，作为基础生长对照实验，为细胞、动物、分子机制所有表型实验提供前置排除证据。

4 相比终点单点OD检测，Bioscreen动态连续监测可捕捉微小生长差异，完全排除生长表型对鞭毛、毒力表型的混杂干扰，建立严谨的实验对照体系。

5 高通量多孔检测模式可一次性完成多菌株平行生长测定，缩短菌株基础表型筛选实验周期，提升整体实验效率。