Emerging roles for ABC transporters as virulence factors in uropathogenic Escherichia coli
ABC转运蛋白作为致尿路致病性大肠杆菌毒力因子的新兴作用
来源：PNAS, 2024, Volume 121, Issue 16, Article ID e2310693121, DOI:10.1073/pnas.2310693121
《美国国家科学院院刊》，2024年，第121卷第16期，文章编号e2310693121，DOI：10.1073/pnas.2310693121
摘要
尿路感染75%以上由致尿路致病性大肠杆菌（UPEC）引发，尿液营养匮乏但UPEC仍可在宿主体内快速增殖，其营养摄取与致病关联机制尚不清晰。本研究整合生物信息学、体内Tn-seq转座子筛选、体外液体与脏器琼脂生长实验系统解析转运系统功能；全基因组注释转运子分析显示原核型ABC转运蛋白在各类尿路致病菌中保守性最高。体内筛选结果表明ABC转运相关基因是小鼠尿路定植关键适应因子，分别占液体培养、脏器琼脂、体内定植缺陷基因52.3%、66.2%、37.2%。对筛选出12套核心ABC转运系统构建框内缺失突变株，运动、生长毒力表型出现显著改变；单一转运敲除仅产生微弱定植缺陷，多重氨基酸转运基因联合敲除后小鼠膀胱、肾脏定植能力大幅下降，证明转运系统存在功能代偿冗余。ABC转运蛋白通过摄取氨基酸、金属等宿主稀缺营养调控细菌生长、运动等多重毒力性状，是尿路感染关键致病元件，可作为广谱抗尿路感染新型药物靶点。
关键词
致尿路致病性大肠杆菌；ABC转运蛋白；尿路感染；细菌毒力；转座子测序；营养摄取；功能冗余；小鼠感染模型；细菌生长曲线
研究目的
1 系统筛选UPEC CFT073全基因组转运系统，明确各类转运家族在尿路定植中的贡献度。
2 解析原核型ABC转运蛋白调控细菌生长、运动等毒力表型的生理功能。
3 阐明ABC转运系统之间的功能代偿冗余效应，解释单基因敲除定植缺陷微弱的分子原因。
4 结合体外培养、脏器琼脂、小鼠体内三重筛选，区分宿主特异性与通用营养转运基因。
5 评估ABC转运蛋白作为广谱尿路感染抗菌靶点的应用潜力。
研究思路
1 生物信息学分析：利用PATRIC数据库比对457株UPEC、139株肠出血大肠杆菌、93株肠道共生菌转运序列，统计ABC转运蛋白物种保守性。
2 转座子文库高通量筛选：构建466株转运基因转座突变体，分三组进行小鼠上行尿路感染Tn-seq测序，统计膀胱、肾脏、尿液内定植缺陷突变。
3 体外液体生长测定：采用Bioscreen仪器检测所有突变株在LB、无菌人尿液中生长动力学，获取倍增时间、最大OD、曲线AUC指标。
4 脏器琼脂表型筛选：制备小鼠膀胱、肾、肝、脾均质琼脂培养突变株，扫描定量菌落生长密度，鉴定宿主专属营养转运基因。
5 单套ABC操纵子敲除验证：对12个多重缺陷ABC系统构建完整缺失株，检测液体生长、半固体泳动能力。
6 多重转运敲除体内共竞争实验：依次构建双、三、四重氨基酸转运突变株，小鼠共感染测定竞争指数。
7 qPCR转录检测野生与单敲菌株转运基因表达变化，明确代偿性转录上调机制。
8 整合多组实验数据，构建ABC转运蛋白调控UPEC尿路致病模型。
研究亮点
1 大规模无偏筛选证实原核ABC转运家族是UPEC定植最核心转运系统，跨多种尿路致病菌高度保守，适合广谱药物开发。
2 首次完整证实ABC氨基酸转运系统存在显著功能冗余，仅多重基因敲除才能造成体内定植大幅衰减。
3 建立体外液体、脏器离体琼脂、动物体内三重分层筛选体系，精准区分通用营养基因与宿主感染特异性适应基因。
4 证明ABC转运不仅调控营养摄取，还全局性调控细菌运动等多重毒力表型，属于多效性毒力因子。
5 提出靶向ABC转运的抑菌策略，相比传统抗生素选择压力更低，不易诱导耐药菌产生。
可延伸的方向
1 筛选特异性抑制原核ABC转运的小分子抑制剂，体外与小鼠模型验证抑菌效果。
2 解析Opp、Dpp、Glt等核心ABC转运蛋白晶体结构，设计竞争性底物类药物。
3 探究不同糖尿病、免疫缺陷宿主尿液环境下ABC转运基因表达变化。
4 在克雷伯菌、奇异变形杆菌等其他尿路致病菌验证ABC转运致病保守机制。
5 改造UPEC ABC转运缺陷菌株，构建减毒活疫苗候选菌株。
测量的数据及研究意义
1 多菌株转运蛋白同源保守性BLAST统计数据（图1），量化六大转运家族在不同大肠杆菌菌群、多种尿路致病菌中的分布占比，证明原核ABC转运跨尿路致病菌高度保守，具备广谱靶点开发价值。
2 小鼠体内Tn-seq转座子定植缺陷统计数据（图2），分尿液、膀胱、肾脏三个器官统计缺陷突变数量，明确ABC转运是各部位定植核心适应因子，直观体现不同器官微环境对转运基因需求存在差异。
3 Bioscreen全自动生长曲线动力学数据（图3），同步测定466株突变株在LB、人尿液中的倍增时间、最大OD、曲线下面积，区分仅体外生长缺陷、仅体内定植缺陷、体内外均缺陷三类突变菌株。
4 小鼠脏器琼脂菌落密度定量数据（图4），模拟体内组织营养环境，筛选仅在宿主组织中生长受损的转运突变，补充液体培养局限，鉴定宿主专属营养摄取通路。
5 12套ABC单敲突变株生长、泳动直径数据（图5），直接验证Liv、Ycb等ABC系统缺失会同时抑制细菌生长与运动能力，证实ABC转运全局性调控细菌多重毒力性状。
6 多重ABC转运敲除小鼠共竞争指数Log2值（图6），单敲菌株定植缺陷微弱，四重突变株膀胱、肾脏定植能力显著下降，直观证明ABC氨基酸转运系统存在转录代偿与功能冗余。
7 qPCR转运基因相对表达数据，Opp缺失株会上调Dpp等互补肽转运基因，从转录层面解释冗余代偿机制，证明不同碳源环境下ABC转运表达时序存在特异性调控。
结论
1 原核型ABC转运蛋白在各类尿路致病菌基因组中高度保守，是UPEC适应尿液营养匮乏微环境的核心适应因子。
2 ABC转运系统可调控氨基酸、金属离子摄取，缺失后会同时抑制细菌增殖、运动等多重毒力表型。
3 各类寡肽、氨基酸ABC转运系统存在显著功能冗余，单基因敲除可通过其他转运转录上调实现代偿，仅多重联合敲除能大幅削弱小鼠尿路定植能力。
4 体外液体培养仅能筛选通用生长必需基因，小鼠脏器琼脂与体内Tn-seq可鉴定宿主感染特异性营养转运通路。
5 ABC转运蛋白是极具潜力的新型抗尿路感染药物靶点，靶向该类转运可抑制细菌增殖且不易诱导耐药菌株产生。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本研究使用Bioscreen-C高通量微生物生长分析仪，96孔板同步并行466株转座突变株，37℃持续20小时每15分钟自动采集OD600，无需人工多次取样，极大降低人为操作带来的读数、时间误差。
2 仪器可完整记录延滞期、对数期、稳定期全生长周期，自动计算倍增时间、最大光密度、曲线下面积AUC三项定量指标，相比单点OD检测可精准量化细微生长差异。
3 统一标准化LB、无菌人尿液两套培养基体系，所有突变株、野生对照同步检测，数据统计学可比性强，可清晰区分突变株生长受损程度。
4 作为初筛分层工具，快速筛除仅体外生长缺陷突变，缩小后续动物实验样本量，大幅降低小鼠体内实验成本与工作量。
5 生长曲线数据为体内定植表型提供基础对照，排除“菌株生长缓慢导致定植下降”混杂变量，证明ABC转运直接调控宿主感染适配能力，而非仅影响基础增殖。