全自动生长曲线分析仪

Exploring solute binding proteins in Pseudomonas aeruginosa that bind to γ‐aminobutyrate and 5‐aminovalerate and their role in activating sensor kinases

探究铜绿假单胞菌中可结合γ-氨基丁酸与5-氨基戊酸的溶质结合蛋白及其在感应激酶激活中的功能

来源：MicrobiologyOpen, Volume 13, Article ID e1415, 2024, DOI:10.1002/mbo3.1415

《MicrobiologyOpen》第13卷，文章编号e1415，2024年，DOI：10.1002/mbo3.1415

摘要

多数感应组氨酸激酶（SHK）需要结合配体的溶质结合蛋白（SBP）激活，且编码SBP与SHP的基因常相邻排布。本研究选取铜绿假单胞菌PAO1基因组中紧邻AgtS、AruS感应激酶的3个SBP（PA0602、AgtB、PA4985）开展功能解析。热位移、微量等温滴定量热实验结果显示PA0602、PA4985优先结合γ-氨基丁酸（GABA），其次结合5-氨基戊酸（5-AMV），同时可结合乙二胺；AgtB仅特异性识别5-AMV。但体外微量热互作实验、细菌双杂交（BACTH）均证实，无论是否添加对应配体，3种SBP均无法与同源AgtS、AruS感应激酶配体结合域发生相互作用。既往研究已鉴定PA0222为GABA特异性SBP，本研究证明铜绿假单胞菌存在多套识别GABA的SBP，该冗余特征或与GABA调控细菌毒力相关；同时说明SBP与SHK基因相邻不代表二者存在功能互作关系。

关键词

铜绿假单胞菌；溶质结合蛋白；感应组氨酸激酶；γ-氨基丁酸；5-氨基戊酸；蛋白配体互作；微量等温滴定量热；细菌双杂交；信号转导

研究目的

1 解析铜绿假单胞菌PA0602、AgtB、PA4985三种SBP的配体结合谱，明确各自最优结合底物与结合亲和力。

2 验证基因组相邻排布的SBP与AgtS、AruS感应激酶是否存在配体依赖的蛋白互作，验证“基因邻近即功能关联”的普遍假说。

3 阐明铜绿假单胞菌多种SBP识别GABA的冗余生理意义，解析GABA作为环境信号调控细菌生理的分子基础。

4 建立一套体外蛋白互作+体内细菌双杂交联合验证SBP-激酶互作的标准化实验流程。

研究思路

1 生物信息分析：定位agtSR、aruSR基因簇排布，解析AgtS、AruS跨膜结构域，截取胞外配体结合域（LBD）用于体外表达。

2 蛋白构建与纯化：构建带His标签的PA0602、AgtB、PA4985、AgtS-LBD、AruS-LBD表达质粒，大肠杆菌异源表达、亲和层析纯化，凝血酶切除标签排除标签干扰。

3 高通量配体筛选：热位移实验（TSA）使用Biolog全化合物库筛选全部候选配体，以Tm升高2℃作为结合判定阈值。

4 定量结合验证：等温滴定量热（ITC）测定各SBP与GABA、5-AMV、多胺等配体的解离常数KD，量化结合亲和力。

5 体外蛋白互作检测：ITC滴定SBP与对应激酶LBD（有无配体两组），验证直接结合能力。

6 体内互作验证：BACTH细菌双杂交系统共转化PA4985与AruS-LBD融合质粒，添加不同配体观察显色。

7 生理表型验证：使用Bioscreen分析仪，以各类配体为唯一碳源测定铜绿假单胞菌生长曲线，确认底物可被细菌利用。

8 综合组学与已有文献，讨论多SBP识别GABA的冗余机制与进化意义。

研究亮点

1 推翻现有经验假说：SBP与感应激酶基因在基因组相邻不代表二者存在激活型蛋白互作，打破“基因共定位即功能耦合”筛选思路。

2 首次完整表征PA0602、AgtB、PA4985配体谱，区分广谱型（GABA+5-AMV）与单一底物特异性SBP（AgtB仅结合5-AMV）。

3 发现铜绿假单胞菌存在3种高亲和力GABA结合SBP（PA0222、PA0602、PA4985），揭示溶质结合蛋白底物识别冗余现象。

4 联合热位移高通量筛选、ITC定量亲和力、体外互作滴定、体内细菌双杂交四重实验，多维度排除SBP与同源激酶的互作可能，证据链完整。

5 证实GABA、5-AMV可作为唯一碳源支撑铜绿假单胞菌生长，解释该类信号分子兼具营养与毒力调控双重功能。

可延伸的方向

1 筛选AgtS、AruS激酶真正的上游激活SBP，挖掘其他基因组远端SBP与二者的互作关系。

2 定点突变PA0602/PA4985底物结合口袋，改造配体特异性，构建GABA生物传感蛋白。

3 构建三种SBP单、多基因敲除菌株，动物感染模型验证各蛋白对铜绿假单胞菌毒力、生物膜的调控作用。

4 在其他致病假单胞菌中验证SBP-激酶基因邻近无功能关联是否为普遍规律。

5 基于GABA信号通路筛选小分子拮抗剂，抑制铜绿假单胞菌感染毒力。

测量的数据及研究意义

1 热位移实验Tm偏移数据（图2、图4、图5），高通量一次性筛选数百种小分子，快速锁定三种SBP核心结合配体，缩小定量验证范围，Tm升高幅度直观反映配体结合稳定能力，初步区分强、弱结合底物。

2 ITC微量热滴定结合曲线与KD解离常数（图3、图6、表1），精准量化各蛋白与GABA、5-AMV、精胺、乙二胺的结合亲和力，明确PA4985对GABA结合能力最强，滴定无放热信号，直接证明SBP与同源激酶LBD不存在直接分子相互作用，排除体外结合可能性。

3 凝血酶切SDS-PAGE电泳图，验证His标签可完全切除，排除标签空间位阻干扰蛋白互作实验结果，保证结论可靠。

4 AruS-LBD热变性曲线，证明纯化AruS配体结合域折叠完整，蛋白构象正常，排除蛋白失活导致无互作的实验误差。

5 BACTH细菌双杂交显色平板结果（图7），体内活细菌层面验证，有无外源配体均无互作显色，从细胞生理层面佐证体外ITC结论，设置正负对照，排除质粒、菌株背景干扰。

6 Bioscreen全自动生长曲线OD600时序数据，定量证明GABA、5-AMV、精胺可单独作为碳源支撑铜绿假单胞菌增殖，解释细菌表达多套结合蛋白的生理需求，直观对比不同底物利用效率，GABA为最优碳源，对应SBP高亲和力结合特征。

7 多序列比对同源性数据，明确PA0602、AgtB、PA4985序列同源关系，解释三者配体谱相似的进化根源。

结论

1 PA0602、PA4985可高亲和力结合GABA与5-AMV，AgtB仅特异性识别5-氨基戊酸；三种蛋白均可结合乙二胺、精胺等多胺类小分子，但亲和力更低。

2 基因组位置紧邻的SBP（PA0602/AgtB对应AgtS，PA4985对应AruS）无论有无对应配体，均无法与同源感应激酶胞外结构域发生蛋白互作，基因相邻不能作为功能关联判定依据。

3 铜绿假单胞菌存在至少3种特异性结合GABA的溶质结合蛋白，底物识别冗余，该现象与GABA兼具碳源、毒力调控信号双重功能相关。

4 GABA、5-AMV可作为唯一碳源供给铜绿假单胞菌生长，是该菌重要环境感知与代谢信号分子。

5 热位移、等温滴定量热、细菌双杂交多手段联合可完整验证SBP-感应激酶互作关系，为细菌双组分系统上游信号挖掘提供标准化实验方案。

使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义

1 采用Bioscreen高通量微生物生长分析仪，96孔微孔板同步批量检测多种单一碳源培养组，全程37℃自动孵育，每小时连续记录OD600，无需人工定时取样，大幅减少人为操作带来的读数、时间误差。

2 长达45小时连续动态监测细菌完整生长周期，可清晰区分延滞期、对数期、稳定期，精准量化GABA、5-AMV、精胺、乙二胺、葡萄糖各组生长速率与最大菌体密度，静态单点OD检测无法实现时序定量对比。

3 同步设置无碳空白对照组、葡萄糖阳性对照，标准化培养基pH、温度、振荡条件，各组数据具备高度统计学可比性，直观证明GABA是铜绿假单胞菌最偏好的外源碳信号分子。

4 与体外蛋白结合实验形成互补证据链：SBP对GABA亲和力最高，对应细菌利用GABA生长速度最快，将分子结合特性与细菌整体生理代谢表型关联，完善蛋白功能生物学解释。

5 高通量平行检测可一次性完成多种配体梯度重复实验，大幅缩短底物代谢表型筛选周期，为后续基因敲除毒力实验提供代谢表型基础数据。