Multidisciplinary Methods for Screening Toxic Proteins from Phages and Their Potential Molecular Targets
多学科方法筛选噬菌体毒性蛋白及其潜在分子靶点
来源：Methods in Molecular Biology, vol. 2793, pp.237-256, 2024, DOI:10.1007/978-1-0716-3798-2_15
《分子生物学方法》 第2793卷，2024年，页码237-256，DOI :10.1007/978-1-0716-3798-2_15
摘要
本章完整介绍一套用于噬菌体未知功能毒性假想蛋白（toxHPUF）鉴定、表征与功能分析的综合多学科实验流程。整套体系分为体内细菌毒性验证、生物信息学预测、比较基因组靶标挖掘、蛋白互作可视化四大模块。体内实验包含传统平板菌落计数毒性筛选、高通量二代测序（NGS）筛选、诱导表达后生长曲线监测、点滴抑菌实验；生物信息学部分整合AlphaF2、Phyre2、HHpred完成蛋白结构与功能预测，利用比较基因组、HDock分子对接、PyMOL可视化筛选细菌潜在作用靶点。整套流程从湿实验筛选到生信分子机制解析形成完整技术管线，可快速发掘噬菌体抑菌蛋白，为新型抗菌药物靶点开发奠定实验基础。作者团队前期已利用该方法从多株致病噬菌体中筛选出跨宿主毒性蛋白，改良后的NGS高通量方案相较传统平板法效率、准确度、可靠性全面提升。
关键词
噬菌体；未知功能假想蛋白；毒性蛋白；抗菌耐药；二代测序；蛋白质组；分子对接；生长曲线检测；生物信息学分析
研究目的
1. 建立一套兼顾小规模筛选与高通量批量筛查噬菌体毒性假想蛋白标准化多学科实验操作流程。
2. 搭建从蛋白毒性表型验证到分子靶标预测的完整分析管线，打通湿实验与生信预测壁垒。
3. 优化NGS高通量筛选体系，解决传统平板筛选通量低、耗时久的缺陷。
4. 提供完整的噬菌体毒性蛋白结构、互作靶点分析操作方案，助力抗耐药新型抗菌分子挖掘。
研究思路
1. 噬菌体前处理：完成噬菌体纯化、基因组提取测序、LC-MS/MS蛋白组检测，剔除噬菌体结构类假想蛋白，缩小待筛选候选基因范围。
2. 小规模毒性初筛：构建各HPUF克隆载体，采用平板菌落计数法，设置已知毒性/无毒对照，初步判定抑菌蛋白。
3. 高通量NGS筛选：批量构建混合基因文库，转化后对比连接文库与传代质粒文库测序reads占比，根据比值判断蛋白毒性。
4. 毒性精准验证：使用严谨诱导型载体表达候选toxHPUF，借助Bioscreen仪器连续监测细菌生长曲线，辅以点滴抑菌实验直观验证抑菌表型。
5. 生信机制解析：利用多款在线工具预测蛋白三维结构与功能域，比较致病菌与模式菌同源蛋白，分子对接预测toxHPUF与宿主靶蛋白互作，PyMOL可视化互作界面。
研究亮点
1. 整合传统平板筛选、NGS高通量测序、全自动生长曲线检测、多维度生物信息学预测，形成一套可直接复用的完整标准化实验手册。
2. 创新NGS高通量筛选算法，通过文库reads比值量化蛋白毒性，大幅提升筛选效率，适配全噬菌体基因组批量挖掘。
3. 区分初筛与精准验证两套表达体系，漏表达载体用于初筛，严谨诱导载体用于结果确证，规避本底表达干扰造成假阳性。
4. 完整配套噬菌体纯化、测序、蛋白组、分子克隆、分子对接全流程试剂仪器清单与分步操作细节，可直接用于实验室重复。
5. 兼顾表型定量（生长曲线OD）与直观定性（点滴抑菌）两种毒性验证手段，结果可信度更高。
可延伸的方向
1. 结合荧光显微镜时序成像，观测toxHPUF作用后细菌形态、分裂变化，解析抑菌细胞层面机制。
2. 构建细菌双杂交、Pull-down体外实验，分子对接预测的蛋白互作进行体内外实验验证。
3. 针对筛选得到的toxHPUF改造截短突变体，定位发挥抑菌功能的核心结构域。
4. 将这套筛选管线拓展至真菌病毒、放线菌病毒，挖掘真核微生物抑制蛋白。
5. 基于鉴定的细菌靶蛋白设计小分子抑制剂，开发新型抗ESKAPE耐药菌抗菌增效剂。
测量的数据及研究意义
1 平板菌落计数CFU数据
数据意义：小规模筛选的基础定量指标，通过标准化对照校正菌落数量，直观反映目标蛋白对宿主细菌的抑制增殖能力，完成候选基因初次筛选。
2 NGS测序reads占比与毒性比值数据
数据意义：高通量筛选核心量化指标，质粒文库/连接文库比值小于1判定为毒性蛋白，实现无人工平板操作的批量基因筛查，大幅缩短筛选周期。
3 Bioscreen仪器连续OD600生长曲线数据
数据意义：动态定量记录诱导表达后细菌长时间增殖变化，区分缓慢抑菌、快速杀菌、无毒性三类蛋白表型，精准量化毒性强弱，作为核心定量验证依据。
4 点滴抑菌平板稀释梯度数据
数据意义：直观可视化毒性结果，通过梯度稀释观察抑菌活性范围，作为生长曲线定量结果的定性辅助佐证。
5 AlphaFold2、Phyre2蛋白三维结构、RMSD比对数据
数据意义：预测蛋白二级结构、功能结构域，筛选具备互作潜力的候选毒性蛋白，排除无功能无序短肽，缩小靶标分析范围。
6 HDock蛋白分子对接氢键、界面残基数据
数据意义：预测toxHPUF与宿主必需蛋白结合模式，锁定潜在药物分子靶点，为后续机制验证与药物开发提供结构依据。
结论
1 本研究建立一套包含湿实验筛选、生信解析的多学科标准化流程，可高效筛选噬菌体来源未知功能毒性蛋白。
2 传统平板法适合少量基因初筛，改良NGS测序高通量方案通量、准确度、效率全面优于平板法，适用于全基因组批量挖掘。
3 低渗漏诱导载体+Bioscreen生长曲线定量+点滴抑菌定性组合，可精准、可靠验证候选蛋白体内抑菌毒性。
4 联合蛋白结构预测、比较基因组、分子对接工具，能够高效预测toxHPUF靶向的细菌必需蛋白，明确潜在抗菌靶点。
5 整套操作手册试剂、仪器、计算流程完备，可直接复用，为噬菌体来源新型抗菌分子研发提供完整实验技术支撑。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 仪器搭配蜂窝式多孔培养板，可同步大批量检测不同基因、多生物学重复菌株，自动化连续16–20小时监测OD600吸光度，无需人工间断取样，降低人为操作误差。
2 持续动态采集全生长周期数据，可区分延迟抑菌、强杀菌、无毒性三种不同蛋白作用表型，单点OD检测无法捕捉时序生长差异，定量结果更精细。
3 仪器内置振荡与间歇读数程序，模拟液体培养真实环境，保证细菌均匀悬浮，OD数值重复性、统计学可靠性更高，可直接用于毒性强弱量化对比。
4 作为诱导表达体系核心定量验证手段，可排除平板静态培养局限，精准反映toxHPUF在液体环境下对细菌增殖抑制真实效力，为NGS高通量初筛结果提供金标准验证。
5 可同步设置空载体、无毒蛋白、已知毒性蛋白多重对照，标准化实验变量，统一不同批次实验的数据对比基准，提升实验可重复性。