CRISPR screen for protein inclusion formation uncovers a role for SRRD in the regulation of intermediate filament dynamics
基于蛋白包涵体形成的CRISPR筛选揭示SRRD调控中间丝动力学与聚集体组装的作用
来源：PLOS Genetics, Volume 20, Issue 2, Article ID e1011138, 2024, DOI:10.1371/journal.pgen.1011138
《PLOS遗传学》，第20卷第2期，文章编号e1011138，2024年，DOI：10.1371/journal.pgen.1011138
摘要
神经退行性疾病标志性特征是细胞内大量蛋白包涵体积累，但调控蛋白聚集的分子因子尚不明确。传统遗传筛选多以细胞毒性为检测指标，无法直接识别聚集调控因子。本研究将全基因组CRISPR敲除筛选与流式脉冲波形分析（PulSA）联用，以ALS致病蛋白TDP-43为模型，直接筛选调控蛋白包涵体形成的基因。筛选鉴定出已知蛋白稳态调控基因，同时发现功能未被解析的SRRD是调控包涵体形成核心因子。APEX邻近标记质谱显示SRRD定位于中间丝、二硫键形成相关蛋白附近；SRRD敲除后波形蛋白中间丝网络碎片化，蛋白毒性应激下聚集体（aggresome）组装受阻，无法形成波形蛋白包裹笼结构。SRRD可定位于未折叠蛋白与聚集体，其N端低复杂度结构域足以缓解TDP、FUS等蛋白带来的酵母细胞毒性。本研究建立直接筛选蛋白聚集调控的新型技术体系，揭示SRRD通过调控中间丝动态重塑参与细胞蛋白稳态调控，拓展细胞骨架与蛋白聚集关联机制认知。
关键词
CRISPR全基因组筛选；SRRD；TDP-43；蛋白包涵体；聚集体；中间丝；波形蛋白；蛋白稳态；神经退行性蛋白聚集；流式脉冲波形分析
研究目的
1 建立结合CRISPR敲除文库与PulSA流式检测的高通量筛选体系，直接筛选调控TDP-43包涵体形成的人类细胞基因。
2 鉴定全新蛋白调控因子SRRD，解析其亚细胞互作蛋白网络与细胞定位特征。
3 阐明SRRD对中间丝骨架动力学、应激聚集体组装的调控作用。
4 明确SRRD发挥抗蛋白毒性功能的关键结构域（N端低复杂度区域）。
5 建立中间丝重塑与细胞蛋白稳态、致病蛋白聚集的关联调控模型。
研究思路
1 工具构建：构建可诱导mClover3标记TDP-43ΔNLS聚集报告细胞，验证PulSA流式可区分弥散/点状聚集荧光信号。
2 全基因组CRISPR筛选：Brunello sgRNA慢病毒文库感染293T细胞，诱导TDP表达后分流式聚集阳性、阴性细胞群，扩增sgRNA二代测序，统计差异基因。
3 单基因验证：靶向SRRD构建敲除、CRISPR干扰细胞，重复TDP聚集实验验证筛选结果。
4 APEX邻近标记质谱：构建SRRD-V5-APEX融合稳定细胞，有无蛋白酶体抑制剂MG132两组标记，质谱鉴定SRRD邻近互作蛋白。
5 细胞骨架成像：野生、SRRD敲除、回补细胞免疫荧光染色波形蛋白，观察中间丝形态。
6 聚集体表型检测：MG132诱导蛋白毒性，染色HDAC6、波形蛋白，统计聚集体数量与波形蛋白笼包裹比例。
7 SRRD截短体功能验证：构建全长、N端缺失、仅N端片段表达载体，转染细胞检测TDP聚集程度。
8 酵母毒性模型：GAL诱导TDP、FUS表达，Bioscreen仪器测定酵母生长曲线，评估SRRD各片段解毒能力。
9 整合质谱、荧光、生长数据，绘制SRRD调控中间丝与蛋白聚集分子模型。
研究亮点
1 开发PulSA联合CRISPR无偏筛选新方法，跳过细胞毒性间接指标，直接定量蛋白包涵体形成，筛选精准度大幅提升。
2 首次发现功能未知蛋白SRRD是调控TDP-43等致病蛋白聚集的核心调控因子。
3 阐明SRRD特异性结合中间丝、二硫键调控蛋白，缺失会导致波形丝网络破碎、聚集体包裹笼完全缺失。
4 证实SRRD仅依靠N端低复杂度结构域即可结合未折叠蛋白、缓解蛋白毒性，明确功能核心区域。
5 体外细胞、酵母双模型验证SRRD保守抗聚集功能，建立细胞骨架动态重塑调控蛋白稳态全新通路。
可延伸的方向
1 解析SRRD与波形蛋白、二硫键异构酶的直接分子互作晶体结构，明确结合位点。
2 在iPSC分化神经元中敲低SRRD，验证其在神经细胞TDP病理中的调控作用。
3 靶向SRRD N端结构域设计小分子肽类，抑制TDP/FUS病理性聚集。
4 探究SRRD调控钙信号、二硫键稳态的上游分子通路。
5 拓展筛选其他肌萎缩侧索硬化相关致病蛋白（C9orf72等）的聚集调控因子。
测量的数据及研究意义
1 PulSA流式分选CRISPR筛选火山图与互作网络数据（图1、图1F），直接区分促进/抑制TDP聚集的基因，锁定SRRD为关键调控因子，富集分子伴侣、蛋白降解、细胞骨架相关通路，为后续机制实验提供候选靶点。
2 APEX邻近标记质谱差异蛋白、GO富集、互作聚类数据（图2、图2E），证明SRRD在细胞质内紧邻中间丝蛋白、二硫键异构酶、钙结合蛋白，提示SRRD功能与中间丝氧化、钙依赖动态组装过程紧密关联。
3 野生/SRRD敲除/回补细胞波形蛋白荧光成像定量数据（图3、图3F），SRRD缺失后波形蛋白纤维碎片化，神经元中间丝INF分布紊乱，直接证明SRRD是维持中间丝完整动态网络的必需蛋白。
4 MG132诱导聚集体荧光染色、定量统计数据（图4），SRRD敲除细胞聚集体生成量大幅下降，几乎无波形蛋白环绕笼，说明SRRD通过调控中间丝结构保障应激聚集体完整组装。
5 SRRD不同截短体介导TDP聚集流式定量数据（图6C），仅含N端低复杂度片段即可显著降低细胞内TDP包涵体比例，定位SRRD发挥抗聚集核心功能结构域。
6 酵母Bioscreen生长曲线、斑点稀释毒性数据（图6D、6E、6F），SRRD全长与N端片段可显著缓解TDP、FUS诱导的酵母生长抑制，跨物种验证SRRD抑制病理性蛋白聚集的保守功能。
7 有无MG132处理SRRD邻近蛋白质谱对比数据（图5），蛋白毒性应激下SRR会募集蛋白酶体、中心体相关降解复合物，解释SRRD促进未折叠蛋白向聚集体转运的分子基础。
结论
1 本研究建立PulSA联合全基因组CRISPR筛选技术，可直接高通量筛选调控蛋白包涵体形成的人类细胞基因，区别于传统毒性筛选方法。
2 SRRD是全新细胞骨架调控蛋白，在稳态与蛋白应激条件下均定位于中间丝周边，依赖钙、二硫键相关分子调控中间丝完整动态网络。
3 SRRD缺失会造成波形蛋白中间丝碎片化，蛋白酶体抑制诱导的聚集体无法形成典型波形蛋白包裹笼，大幅降低细胞隔离未折叠蛋白的能力。
4 SRRD的N端低复杂度无序结构域是核心功能区域，单独表达即可减少TDP、FUS等神经致病蛋白聚集，缓解细胞毒性。
5 蛋白毒性应激时SRRD会招募蛋白酶体、中心体组分至聚集体，协同完成未折叠蛋白隔离与降解，建立中间丝介导的新型细胞蛋白稳态调控通路。
使用芬兰 Bioscreen仪器测量数据的研究意义
1 本实验采用Bioscreen高通量酵母培养检测仪，96孔同步平行多株酵母菌株，每15分钟自动采集OD600，持续48小时完整记录生长全过程，无需人工定时取样涂布，大幅降低人工操作带来的误差与实验工作量。
2 仪器动态连续记录延滞期、对数期、稳定期OD变化，可精准计算曲线下面积、生长速率，定量对比SRRD不同截短体缓解TDP/FUS毒性的强弱差异，单点终点OD无法区分细微毒性差别。
3 标准化统一酵母诱导培养基、温度、振荡条件，空载对照、全长SRRD、N端片段、缺失片段多组同步测定，数据统计学可比性强，清晰证明仅N端结构域具备解毒功能。
4 酵母作为简化真核模型，Bioscreen生长定量数据为人类细胞内TDP聚集表型提供跨物种功能佐证，完善SRRD抗聚集功能证据链。
5 高通量批量检测可一次性完成多片段、多致病蛋白毒性平行实验，快速筛选SRRD核心功能区段，缩短结构功能验证实验周期。