Functional evaluation of Bacillus licheniformis PF9 for its potential in controlling enterotoxigenic Escherichia coli in weaned piglets
地衣芽孢杆菌PF9防控断奶仔猪产肠毒素大肠杆菌的功能潜力评价
论文来源：Translational Animal Science，2024，文章txae050，DOI：10.1093/tas/txae050
一、摘要内容总结
断奶仔猪腹泻（PWD）主要由F4型产肠毒素大肠杆菌（ETEC）引发，抗生素促生长添加剂限用后亟需益生菌替代方案。本研究从散养无抗猪场粪便分离耐热地衣芽孢杆菌PF9，先开展体外特性验证，再构建ETEC攻毒断奶仔猪动物模型，设置空白对照组、攻毒阴性组、抗生素安普霉素阳性组、PF9益生菌组四组试验。体外结果显示PF9耐胃酸、高胆盐，可显著延长ETEC感染秀丽隐杆线虫存活时间；动物试验表明日粮添加2.5×10⁹ CFU/kg PF9可显著降低仔猪腹泻评分，改善十二指肠、空肠、回肠绒毛高度，上调紧密连接蛋白（ZO-1、occludin）、营养转运蛋白（SGLT1、EAAC1、APN）基因表达；肠道菌群层面降低拟杆菌门丰度，缓解ETEC诱导菌群紊乱。综合证实地衣芽孢杆菌PF9可作为抗生素替代益生菌，修复仔猪肠道屏障、提升营养吸收、减轻ETEC感染损伤。
二、关键词
地衣芽孢杆菌PF9；断奶仔猪；产肠毒素大肠杆菌F4；益生菌；肠道屏障；营养转运；肠道菌群；替抗添加剂
三、研究目的
1. 分离鉴定地衣芽孢杆菌PF9，体外验证耐低pH、高胆盐胁迫能力，利用秀丽隐杆线虫模型初步评估抗ETEC保护效果。
2. 筛选MUC4易感基因型断奶仔猪，建立ETEC F4攻毒动物试验体系，划分4处理组对比生长、腹泻指标。
3. 测定各组仔猪肠道形态（绒毛高度/隐深）、肠道通透性，评价PF9对肠黏膜结构修复作用。
4. 检测空肠紧密连接、营养转运、消化酶、炎症相关基因mRNA表达，解析肠道功能调控分子机制。
5. 基于16S rRNA测序分析回肠、结肠菌群门水平组成与多样性变化，阐明PF9对紊乱肠道菌群的重塑作用。
6. 综合体外+体内数据，评估PF9作为替抗益生菌防控仔猪ETEC腹泻的应用潜力。
四、研究思路
1. 菌株分离鉴定：猪场粪便80℃热处理筛选耐热芽孢，16S rRNA测序结合特异性标记基因确认为地衣芽孢杆菌；Bioscreen高通量仪测定pH2.0、不同胆盐浓度下生长曲线，评估胃肠耐受；秀丽隐杆线虫感染试验统计12天存活率。
2. 仔猪分组与攻毒：PCR筛选MUC4易感SS/RS基因型28日断奶仔猪32头，均分4组：无攻毒空白NNC、ETEC攻毒NC、安普霉素抗生素PC、日粮添加PF9攻毒组PF9，试验周期10 d，攻毒日灌服3 mL 1×10⁷ CFU ETEC F4。
3. 生产与腹泻指标：全程记录日增重ADG、日采食量ADFI、料重比；攻毒后多时间点记录直肠温度、腹泻评分。
4. 肠道组织检测：试验末期屠宰采集十二指肠、空肠、回肠，固定切片测定绒毛高度VH、隐窝深度CD；Ussing腔检测离体肠上皮电阻TEER，口服FITC-D70检测体内肠道通透性。
5. 生化与分子检测：空肠组织测定蔗糖酶、麦芽糖酶、氨肽酶等消化酶活力，谷胱甘肽与总抗氧化能力；qRT-PCR定量紧密连接、营养转运、炎症因子基因相对表达量。
6. 肠道微生物：回肠、食糜提取微生物DNA，16S rRNA V3-V4区Illumina测序，分析菌群α、β多样性与门水平相对丰度。
7. 统计：SAS、R软件单因素方差、Kaplan-Meier生存分析，P<0.05判定差异显著。
五、研究亮点
1. 菌株来源贴合无抗养殖场景，兼具耐热、耐胃酸胆盐特性，可顺利抵达仔猪肠道发挥作用，体外线虫模型直观验证抗致病菌保护活性。
2. 完整体内动物攻毒模型，与抗生素阳性组平行对照，证实PF9缓解仔猪腹泻效果接近安普霉素，具备替抗价值。
3. 多维度肠道功能验证：兼顾形态结构、屏障通透性、消化吸收、基因转录、菌群五大层面，机制证据完整。
4. 分子机制清晰：PF9上调紧密连接基因修复肠屏障，提升葡萄糖、氨基酸转运蛋白表达，改善营养吸收效率。
5. 菌群调控靶向明确：不改变菌群整体多样性，但下调攻毒后升高的拟杆菌门丰度，缓解ETEC诱导肠道微生态失衡。
6. 构建“体外菌株特性—线虫预筛—仔猪体内多指标评价”益生菌标准化功能评估体系。
六、可延伸的方向
1. 设置PF9不同添加剂量梯度，筛选最优日粮添加浓度；开发复合益生菌芽孢制剂。
2. 开展仔猪长期饲养试验，评估PF9对全程生长性能、屠宰肉质的持续影响。
3. 转录组/代谢组联用，深度解析PF9调控仔猪肠道代谢与免疫通路。
4. 田间规模化养殖试验，验证PF9在商品猪场防控仔猪腹泻实际效果。
5. 探究PF9发酵上清抑菌活性，分离其抑菌代谢产物开发天然肠道保护剂。
6. 对比不同芽孢杆菌菌株，筛选适配断奶仔猪高效替抗菌种组合。
七、测量数据、配套图表与对应研究价值
1. Bioscreen菌株耐酸、耐胆盐生长曲线图（图1）：直观证明PF9可耐受模拟胃液与肠道高胆盐环境，为体内定植提供体外依据。
2. 秀丽隐杆线虫存活曲线（图2）：ETEC组线虫12 d存活率仅10%，PF9预处理组近60%，初步验证菌株抗感染保护能力。
3. 仔猪日增重、料重比统计表（表3）：ETEC攻毒显著降低生长性能，PF9组生产指标显著回升，证实促生长效果。
4. 直肠温度、腹泻评分折线图（图3、4）：PF9组腹泻指数显著低于攻毒对照组，与抗生素组无显著差异，直观体现止泻功效。
5. 小肠绒毛高度、隐深度统计表（表4）：ETEC造成绒毛萎缩，PF9添加可显著恢复空肠、回肠绒毛长度，修复肠道结构损伤。
6. 肠上皮TEER、FITC通透数据（表5）：各组肠道通透性无显著差异，说明PF9侧重修复结构而非瞬时屏障渗漏。
7. 消化酶、抗氧化指标表（表6）：PF9组氨肽酶等吸收相关酶活力上调，抗氧化水平无显著改变，核心作用于营养吸收而非氧化应激。
8. 肠道功能基因表达柱状表（表7）：PF9显著上调ZO-1、occludin紧密连接基因与SGLT1、EAAC1转运基因，从分子层面解释肠道修复机制。
9. 回肠/结肠菌群门水平堆叠图、丰度柱状图（图5、6）：ETEC升高变形菌、降低厚壁菌，PF9下调拟杆菌门丰度，平衡紊乱菌群。
10. 菌群α多样性小提琴图、β多样性PCA图（图7、8）：菌株不改变菌群整体丰富度，但重塑物种组成结构。
八、得出的结论
1. 地衣芽孢杆菌PF9耐热，可耐受pH胃酸、高浓度胆汁胁迫；体外线虫模型中可显著提升ETEC感染线虫存活率，具备抗致病菌潜力。
2. F4型ETEC攻毒会降低断奶仔猪日增重、升高腹泻评分，造成小肠绒毛萎缩，下调肠道屏障与营养转运基因，扰乱肠道菌群。
3. 日粮添加2.5×10⁹ CFU/kg地衣芽孢杆菌PF9可显著降低仔猪腹泻程度，恢复小肠绒毛高度，修复受损肠道黏膜结构。
4. PF9显著上调空肠紧密连接蛋白ZO-1、occludin与葡萄糖、氨基酸转运基因SGLT1、EAAC1、APN，提升肠道屏障完整性与营养吸收能力。
5. PF9不改变肠道菌群整体α多样性，但可降低结肠拟杆菌门相对丰度，缓解ETEC感染引发的肠道微生态失调。
6. 地衣芽孢杆菌PF9可作为抗生素替代型益生菌，用于防控ETEC诱发的断奶仔猪腹泻、改善仔猪肠道健康，具备养殖应用前景。
九、芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据的研究意义
1. 96孔高通量板同步设置不同pH、多梯度胆盐组别，一次性完成生物学重复，消除分批培养温度、溶氧系统误差。
2. 长达72 h连续自动采集OD600浊度，完整记录菌株适应、对数、稳定生长全过程，精准量化不同胁迫下生长抑制程度。
3. 直观判定PF9在肠道模拟环境下的存活增殖能力，快速筛选具备体内定植潜力益生菌株。
4. 全程恒温统一振荡培养环境，浊度检测重复性、统计学可信度高于人工单点分光测定。
5. 输出标准化生长时序折线图作为菌株益生潜力体外核心支撑图表。
6. 该高通量体系可标准化用于芽孢杆菌、乳酸菌等益生菌胃肠胁迫耐受性批量快速初筛，大幅缩短体外筛选试验周期。