The contribution of BvgR, RisA, and RisS to global gene regulation, intracellular cyclic-di-GMP levels, motility, and biofilm formation in Bordetella bronchiseptica
BvgR、RisA、RisS对支气管败血波氏杆菌全局基因调控、胞内c-di-GMP水平、运动能力及生物膜形成的作用
论文来源：Frontiers in Microbiology，2024，文章编号1305097，DOI：10.3389/fmicb.2024.1305097
一、摘要内容总结
支气管败血波氏杆菌是人畜共患高传染性呼吸道致病菌，Bvg二元系统是其核心毒力调控通路，可介导细菌在毒力型（Bvg+）、非毒力型（Bvg-）表型间切换。本研究构建ΔbvgR、ΔrisA、ΔrisS、ΔrisAS及RisA磷酸化缺陷突变株risAD60N，结合RNA-seq转录组、LC-MS/MS环二鸟苷酸定量、运动与生物膜表型试验，系统解析BvgR、RisS/RisA二元系统及其磷酸化修饰的全局调控功能。结果表明：1.BvgR具备c-di-GMP磷酸二酯酶活性，降解胞内第二信使c-di-GMP，在Bvg+时期抑制运动相关抑制基因（vrg）表达；2.RisA/RisS二元系统广泛调控大量毒力激活基因（vag）与抑制基因，RisA磷酸化是多数基因正常表达的必需条件，但生物膜形成不依赖该修饰；3.BvgR、RisA均时序调控鞭毛运动，BvgR早期抑制运动、RisA作用于后期运动过程；4.BvgR与RisA/RisS均为生物膜形成必需蛋白；5.两套调控通路共同参与c-di-GMP、GMP胞内稳态平衡，二者分工协同塑造细菌毒力、运动、生物膜完整表型，完善波氏杆菌跨通路调控分子网络。
二、关键词
支气管败血波氏杆菌；BvgR；RisA/RisS；二元信号系统；c-di-GMP；转录组；运动能力；生物膜；毒力基因调控
三、研究目的
1. 无痕敲除构建bvgR、risA、risS、risAS缺失株，以及RisA第60位天冬酰胺磷酸化失活突变株risAD60N，获得全套基因缺陷试验菌株。
2. 利用RNA-seq分别在Bvg+（无镁调控）、Bvg-（高镁调控）两种表型条件下，解析各突变株全局转录差异，划分vag、抑制型vrg基因调控模块。
3. LC-MS/MS定量野生型与各突变株胞内c-di-GMP、GMP含量，明确BvgR、RisA对第二信使代谢的调控功能。
4. 软琼脂游动试验验证各基因对细菌时序运动能力的调控作用。
5. 结晶紫微孔板法定量突变株生物膜生成量，判定BvgR、RisA/RisS对生物膜发育的必要性。
6. 整合转录、代谢、表型数据，阐明Bvg通路与Ris二元系统交叉调控机制，对比波氏杆菌与百日咳杆菌调控通路进化差异。
四、研究思路
1. 菌株构建：同源重组载体结合接合转移，构建系列基因缺失株、点突变株，PCR+测序验证基因型；设置野生株KM22、Bvg+/Bvg-锁定株作为对照。
2. 生长动力学：Bioscreen高通量仪监测所有菌株在有无50 mM Mg²⁺培养基24 h生长曲线，确认突变不影响基础增殖能力。
3. 转录组测序：Bvg+、Bvg-两种培养条件下收集对数期菌体，提取总RNA去除rRNA，Illumina平台测序，DeSeq2筛选差异基因，聚类划分调控亚群。
4. 环核苷酸定量：甲醇-丙酮体系提取胞内c-di-GMP、GMP，LC-MS/MS多反应监测模式定量，内标校正活菌数标准化含量。
5. 运动表型：0.35%软琼脂平板24/48 h测量迁移圈直径，区分早期、后期运动差异。
6. 生物膜测定：96孔板静态培养24 h，结晶紫染色洗脱后A595定量生物膜生物量。
7. 统计分析：单/双因素方差分析+Dunnett多重比较，PCA主成分分析转录样本聚类。
五、研究亮点
1. 首次完整解析支气管败血波氏杆菌BvgR与RisA/RisS双调控通路的协同、分工功能，对比同属百日咳杆菌揭示物种特异性调控差异。
2. 明确BvgR兼具转录抑制与c-di-GMP降解双重功能，直接证实其EAL结构域生理活性。
3. 区分RisA磷酸化的功能依赖性：绝大多数毒力、代谢基因表达需要RisA磷酸修饰，但生物膜形成完全不依赖该修饰。
4. 发现时序调控特征：BvgR仅早期抑制鞭毛运动，RisA调控细菌后期游动，两套蛋白分阶段控制运动表型。
5. 证实BvgR、RisA、RisS均为生物膜形成不可或缺，运动与生物膜两套表型受交叉信号网络协同管控。
6. 构建“转录组-环核苷酸代谢-运动-生物膜”多维度验证体系，系统阐明人畜共患病原菌毒力调控分子通路。
六、可延伸的方向
1. 体外纯化BvgR、RisA蛋白，体外酶活试验直接验证c-di-GMP降解催化活性。
2. 凝胶迁移EMSA试验鉴定RisA、BvgR结合靶启动子序列，明确直接调控靶标。
3. 构建双基因叠加突变株，解析BvgR与Ris通路上下游级联调控关系。
4. 动物呼吸道感染模型，评估各突变株定植、致病、传播能力差异。
5. 筛查小分子抑制剂靶向BvgR/RisA，开发波氏杆菌感染阻断药剂。
6. 大规模临床/动物分离株测序，统计bvg、ris基因序列多态性与毒力表型关联。
七、测量数据、配套图表与对应研究价值
1. Bioscreen菌株24 h生长OD曲线（附图S1）：所有突变株与野生株生长速率无显著差异，排除生长缺陷干扰后续表型结果。
2. 转录组分层聚类热图（图1-3）：直观区分BvgR、RisA、RisS调控的vag、vrg基因亚群，划分依赖/不依赖磷酸化的调控模块。
3. LC-MS/MS c-di-GMP、GMP定量柱状图（图4）：ΔbvgR、risAD60N胞内c-di-GMP显著升高，直接证明BvgR与磷酸化RisA降解第二信使。
4. 软琼脂游动直径柱状图（图5）：24 h ΔbvgR运动增强，48 h ΔrisA运动显著下降，证明二者时序调控特征。
5. 微孔板生物膜定量图（图6）：ΔbvgR、ΔrisA、ΔrisAS生物膜量显著低于野生，证实两类基因均为生物膜必需因子。
6. 转录差异聚类表格（表3-7）：细分各类基因调控模式，明确鞭毛、荚膜、III型分泌系统等核心毒基因的调控归属。
八、得出的结论
1. BvgR是Bvg+状态下关键抑制蛋白，抑制鞭毛、荚膜等vrg基因；同时拥有c-di-GMP磷酸二酯酶活性，降低胞内第二信使浓度。
2. RisA/RisS二元系统全局调控数百个毒力、代谢基因，多数基因表达依赖RisA磷酸化修饰；但生物膜生成过程不需要RisA磷酸激活。
3. BvgR、RisA时序控制细菌运动：BvgR仅在培养早期抑制游动，RisA负责维持后期运动能力，二者作用时期完全分离。
4. BvgR、RisA、RisS三者缺失均会显著削弱生物膜形成能力，两条调控通路共同支撑生物膜发育。
5. Bvg通路与Ris通路协同维持胞内c-di-GMP、GMP稳态，共同介导支气管败血波氏杆菌毒力切换、运动、生物膜三大核心致病表型。
6. 相较于百日咳杆菌，波氏杆菌Ris调控靶基因数量更多，鞭毛、荚膜等毒基因调控模式存在物种分化，是其宿主更广、环境存活能力更强的分子基础。
九、芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据的研究意义
1. 96孔高通量同步野生株、全部单/双突变株、Bvg±对照，有无镁两组平行，一次性完成生物学重复，消除分批培养温、溶氧误差。
2. 24 h连续采集OD600，完整覆盖延滞、对数、稳定期，精准证明各基因敲除不改变基础生长能力，排除生长缺陷干扰表型解读。
3. 直观筛选11 h对数期作为RNA提取标准取样点，为转录组试验提供统一标准化培养条件。
4. 全程恒温振荡统一培养环境，浊度检测重复性、统计学可信度高于人工单点分光测定。
5. 输出标准化生长时序图作为本研究前提对照核心图表，保证转录、运动、生物膜表型结果可靠。
6. 该高通量体系可标准化用于波氏杆菌各类突变株生长性能批量初筛。