Screening for probiotic properties and potential immunogenic effects of lactobacilli strains isolated from various food products
多种食品源乳杆菌益生菌特性及潜在免疫调节效应筛选研究
论文来源：Frontiers in Microbiology，2024年第15卷，文章编号1430582，DOI：10.3389/fmicb.2024.1430582
一、摘要内容总结
乳杆菌是公认安全益生菌，可调节肠道菌群、调控黏膜免疫。本研究从酸面团、生鲜牛乳、开菲尔、传统奶酪8个乳杆菌属分离近300株菌株，系统开展体外益生菌核心特性与安全性筛选；检测耐酸耐胆盐能力、黏液粘附性、溶血活性、抗生素敏感性，筛选出35株兼具益生潜力与生物安全的候选菌株。选取5株代表性菌株无细胞上清液（CFS）作用人结肠HT-29上皮细胞进行免疫试验，结果存在菌株特异性免疫差异：Lactiplantibacillus L_4上清显著下调促炎因子IL-8、IL-1β；L_2、L_5上清上调IL-8，L_1、L_3上清提升IL-1β。该研究建立一套标准化食品源乳杆菌筛选体系，为针对性开发调节肠道稳态、重塑宿主免疫益生菌制剂提供菌株资源与试验依据。
二、关键词
乳杆菌；益生菌筛选；耐酸耐胆盐；黏液粘附；生物安全；无细胞上清CFS；免疫调节；促炎细胞因子IL-8、IL-1β
三、研究目的
1. 对8个属、近300株食品分离乳杆菌进行体外益生初筛，评价模拟胃肠道胁迫耐受（pH3酸、3g/L胆盐）与黏液粘附能力。
2. 完成菌株安全性评估：β溶血试验、9种欧盟标准抗生素MIC耐药检测，剔除不安全菌株。
3. 分析菌株碳水利用谱，评估低聚半乳糖（B-GOS）、菊粉、棉子糖寡糖等益生元促生长效果。
4. 选取5株综合性能最优菌株制备无细胞上清，以IL-1β刺激HT-29肠上皮模型，定量TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表达，解析菌株分泌代谢物免疫调控差异。
5. 建立食品源乳杆菌完整筛选评价流程，区分促炎/抗炎潜力菌株，指导共生制剂开发。
四、研究思路
1. 菌株培养：所有乳杆菌厌氧MRS培养，建立菌株库，来源覆盖酸面团、生鲜乳、开菲尔、奥斯科佩克奶酪。
2. 胃肠道耐受试验：pH3、胆盐3g/L处理1h，活菌对数下降值判定耐受性；96孔板包被猪黏液，结晶紫染色定量粘附OD值。
3. 安全检测：血琼脂平板观察β溶血圈；E-test+微量肉汤稀释法测定9种关键抗生素MIC，剔除耐药菌株。
4. 碳源与益生元利用：API50CH测定全糖发酵谱；Bioscreen高通量仪监测单一益生元为碳源的70h生长曲线，对比促生长等级。
5. 无细胞上清制备：菌株培养至稳定期，离心浓缩40倍、中和pH，MTS法测定对HT-29细胞IC50，选用无毒性2%浓度开展免疫试验。
6. 细胞免疫模型：IL-1β预处理HT-29，加入各菌株CFS孵育，提取RNA通过qRT-PCR检测4种促炎因子mRNA相对表达量。
7. 统计：三组生物学重复，单因素方差+Bonferroni多重比较分析差异显著性。
五、研究亮点
1. 样本规模大，一次性筛选近300株食品源乳杆菌，覆盖8个分类属，系统对比不同来源菌株益生性状差异。
2. 明确菌株特性具有高度种属/菌株特异性：Lactiplantibacillus、Levilactobacillus耐胆盐最优；Lacticaseibacillus耐酸性最强；牛乳分离菌株黏液粘附能力整体突出。
3. 建立多层级筛选逻辑：先胃肠耐受→生物安全→益生元利用→细胞免疫，层层精简得到35株优质候选菌株。
4. 首次证实乳杆菌分泌代谢物（CFS）免疫效应分两类：部分菌株具备抗炎潜力（下调IL-8/IL-1β），部分会激活肠道促炎应答，可按需开发靶向制剂。
5. 益生元适配规律清晰：B-GOS对绝大多数菌株促生长效果最优；仅Lacticaseibacillus可高效利用菊粉。
6. 完整配套高通量生长、细胞分子检测体系，可直接用于发酵食品、益生菌菌种快速筛选。
六、可延伸的方向
1. 对L_4等抗炎优势菌株开展动物肠道炎症模型体内验证。
2. 分离CFS中活性代谢物，解析调控细胞因子的核心分子。
3. 复配抗炎菌株与适配益生元，开发合生素产品。
4. 扩大发酵食品、果蔬源乳杆菌分离范围，扩充菌株资源库。
5. 转录组测序对比高低免疫活性菌株差异基因，挖掘免疫相关功能基因。
6. 评估优势菌株发酵酸奶、发酵蔬菜的实际加工稳定性。
七、测量数据、配套图表与对应研究价值
1. 近300株菌株粘附OD、酸碱胆盐活菌下降统计总图（图1），直观展示不同菌株胃肠适应与粘附性能巨大个体差异。
2. 五大优势菌属耐胆/耐酸箱线图、黏液粘附分布（图2），横向对比属水平性状分化，为菌种定向筛选提供属参考依据。
3. Bioscreen测得各益生元下菌株生长曲线、分级统计（表3），量化B-GOS、菊粉促生长差异，指导共生配方碳源选择。
4. 不同浓度CFS对HT-29细胞活力抑制曲线（图3），确定统一安全2%工作浓度，排除细胞毒性干扰免疫结果。
5. qRT-PCR四种促炎因子相对表达柱状图（图4），清晰区分促炎型（L2/L5）、抗炎型（L4）菌株，直观体现菌株特异性免疫功能。
6. 菌株来源、属水平综合筛选统计表（表2），总结原料与菌株益生特性关联规律，为菌种分离原料选择提供参考。
八、得出的结论
1. 乳杆菌耐酸、耐胆盐、黏液粘附、免疫调节能力均为菌株特异性，不存在统一通用优势属；牛乳来源菌株粘附性能最优，酸面团菌株耐胆盐突出。
2. 300株初筛后剔除耐药、溶血、胃肠耐受差菌株，获得35株兼具益生潜力与生物安全的食品级乳杆菌。
3. B-GOS是适配范围最广的益生元，菊粉仅可被Lacticaseibacillus属菌株高效利用，菌株糖代谢谱存在明显分类特征。
4. 5株代表菌株CFS对肠上皮细胞免疫调控分化显著：L_4上清显著下调IL-8、IL-1β，具备缓解肠道炎症潜力；L2、L5会提升促炎因子，可用于增强黏膜基础免疫。
5. 所有菌株CFS均上调TNF-α，提示乳杆菌代谢物普遍可激活肠道固有免疫，仅下游IL家族调控存在菌株差异。
6. 本套分层体外筛选方案高效可靠，可快速从传统发酵食品中挖掘靶向免疫调节益生菌，适用于功能性食品菌株开发。
九、芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据的研究意义
1. 96孔高通量蜂窝板同步设置空白、葡萄糖对照、四种益生元多菌株组别，一次性平行重复，消除分批培养温、溶氧系统误差。
2. 长达70h连续采集OD600，完整捕捉延滞期、对数、稳定生长期，精准量化不同益生元对菌株促生长强弱。
3. 可直观区分“优于/等同/弱于葡萄糖”三个促生长等级，标准化划分益生元适配菌株，量化筛选指标。
4. 全程恒温厌氧统一培养环境，浊度检测重复性远优于人工单点分光测定。
5. 输出标准化生长时序曲线作为益生元筛选核心定量图表。
6. 该高通量体系可标准化大批量益生菌碳源、胁迫耐受快速筛选，大幅缩短体外初筛试验周期。