Effects of Heterologous Expression of Genes Related L–Malic acid Metabolism in Saccharomyces uvarum on Flavor Substances Production in Wine
葡萄汁酵母中外源表达L-苹果酸代谢相关基因对葡萄酒风味物质生成的影响
论文来源：Foods，2024年第13卷，文章编号2038，DOI：10.3390/foods1313203
一、摘要内容总结
传统葡萄酒酿造需先酵母酒精发酵（AF）、再乳酸菌苹果酸乳酸发酵（MLF）两步工艺，乳酸菌在高酒精、低pH、高SO₂酒液中生长困难，易出现发酵停滞、酒变质，还会生成生物胺等有害副产物。葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）发酵香气优于酿酒酵母，但天然缺少高效苹果酸转运与降解通路。本研究异源表达裂殖酵母MAE1/MAE2、植物乳杆菌/乳酸乳球菌/酒球菌mleS/mleA/mleP单基因、基因组合，在葡萄汁酵母体内构建完整苹果酸代谢通路，实现酒精发酵与苹果酸脱酸同步完成。发酵指标显示：仅转运酶或仅降解酶单株脱酸效果有限；共表达裂殖酵母MAE1转运蛋白+乳酸乳球菌mleS苹果酸酶的工程菌株WYm1S_N脱酸效果最优，发酵后苹果酸含量降至1 g/L行业标准阈值附近；同时该菌株降低异丁醇、异戊醇等不良高级醇，提升乳酸乙酯果香，发酵速率、残糖、乙醇产量与原始菌株无显著差异，兼顾脱酸与风味优化，为一步式葡萄酒发酵菌种改造提供理论与工程菌株支撑。
二、关键词
葡萄汁酵母；苹果酸乳酸发酵；异源表达；MAE；mle；L-苹果酸；高级醇；酯类；葡萄酒风味；代谢工程
三、研究目的
1. 分别将苹果酸转运基因（mleP/MAE1）、降解基因（mleS/mleA/MAE2）单基因导入葡萄汁酵母，验证单基因脱酸能力差异。
2. 构建转运+降解双基因共表达重组菌株，筛选脱酸效率最优基因组合。
3. 检测各工程菌株发酵动力学、CO₂失重、乙醇、残糖、有机酸，评估发酵基础性能稳定性。
4. 定量高级醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯等关键风味物质，解析苹果酸代谢通路改造对香气代谢的调控机制。
5. 阐明MAE转运蛋白与mle/MAE降解酶协同脱酸分子逻辑，开发同步脱酸酿酒酵母底盘。
四、研究思路
1. 载体与菌株构建：以pPGK1启动子构建各类单/双基因重组穿梭质粒，醋酸锂转化野生型葡萄汁WY1，获得全套单、双基因工程菌株；qRT-PCR验证外源基因成功转录。
2. 基础发酵试验：标准化葡萄汁25℃发酵，Bioscreen测定菌体生长曲线，每12 h记录CO₂失重，发酵结束检测乙醇、残糖、L-苹果酸、L-乳酸、丙酮酸。
3. 有机酸定量：HPLC检测胞外、胞内苹果酸含量，对比转运基因提升胞内苹果酸摄取能力。
4. 风味物质检测：气相GC测定正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯等香气组分。
5. 通路机理分析：结合苹果酸代谢、Ehrlich高级醇合成通路，解析苹果酸降解流向改变对丙酮酸、α-酮酸合成的连锁影响。
6. 统计分析：三组生物学重复，t检验比较工程株与野生型差异。
五、研究亮点
1. 突破葡萄酒两步发酵瓶颈，在葡萄汁酵母中完整重构苹果酸代谢通路，实现酒精发酵、苹果酸脱酸一步完成，省去乳酸菌接种工序。
2. 明确单基因缺陷：仅转运或仅降解基因无法实现高效脱酸，必须转运+降解基因协同发挥作用。
3. 筛选最优组合：裂殖酵母MAE1转运蛋白+乳酸乳球菌mleS共表达菌株WYm1S_N可将苹果酸降至1 g/L达标水平。
4. 风味双向优化：降低带来油哈异味的高级醇，增加柔和乳酸乙酯，不改变乙醇、发酵效率，不影响基础发酵性能。
5. 阐明代谢连锁机制：苹果酸经转运进入胞内降解为丙酮酸，分流进入高级醇/酯合成通路，从碳代谢层面解释风味变化规律。
6. 提供工业可用基因改造方案，菌株生长、发酵稳定性无损伤，适配葡萄酒规模化酿造。
六、可延伸的方向
1. 多拷贝强启动子改造，进一步强化MAE1-mleS表达，完全降解苹果酸。
2. 敲除ILV/Ehrlich通路关键基因，进一步降低高级醇含量。
3. 模拟不同酸度葡萄原料，测试工程菌株脱酸适配性。
4. 小试葡萄酒酿造，开展感官品评验证香气提升效果。
5. 整合稳定基因组整合型菌株，消除质粒传代丢失问题。
6. 拓展该改造思路至酿酒酵母底盘，通用化一步发酵菌种。
七、测量数据、配套图表与对应研究价值
1. Bioscreen菌体生长曲线（图9）：全部工程株与野生WY1生长速率、最大菌量无显著差异，证明外源基因不干扰酵母正常增殖。
2. 发酵CO₂累积失重曲线（图10、表4）：各菌株发酵周期、产气、乙醇、残糖基本一致，菌种发酵工业性能稳定。
3. 单基因发酵有机酸柱状图（图3、4、5）：单独降解/转运基因仅小幅降苹果酸，转运基因显著提升胞内苹果酸蓄积，证明转运是脱酸限速步骤。
4. 双基因组合有机酸图（图6、7）：MAE1+mleS组合脱酸幅度最高，接近行业标准1 g/L阈值，确定最优基因搭配。
5. GC风味物质数据表3：WYm1S_N异丁醇、异戊醇显著下降，乳酸乙酯大幅上升，直观体现风味改良效果。
6. 苹果酸代谢、高级醇Ehrlich通路示意图（图1、8）：完整解释苹果酸降解分流调控香气前体的分子逻辑。
7. qRT-PCR基因表达柱状图（图2）：验证所有外源基因在酵母体内稳定表达，证明载体系统有效性。
八、得出的结论
1. 野生葡萄汁酵母缺少高效苹果酸转运系统，单独表达mle或MAE降解基因脱酸效果微弱；仅转运基因MAE1/mleP只能提升胞内苹果酸积累，无法大幅降解。
2. 苹果酸脱酸依赖转运蛋白+降解酶协同作用；共表达裂殖酵母MAE1与乳酸乳球菌mleS的菌株WYm1S_N脱酸效果最优，发酵后苹果酸含量接近葡萄酒工业≤1 g/L标准。
3. MAE1转运苹果酸进入胞内，经mleS催化生成乳酸，丙酮酸生成量改变，分流Ehrlich高级醇合成通路，降低异丁醇、异戊醇等不良风味，提升果香乳酸乙酯。
4. 所有外源单、双基因工程菌株生长、发酵产气、乙醇、残糖与野生株无明显差异，改造不破坏酵母基础酿造性能。
5. 该代谢工程改造可实现葡萄酒一步同步酒精发酵与苹果酸脱酸，规避乳酸菌发酵缺陷，同时优化酒体香气，具备工业化应用潜力。
九、芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据的研究意义
1. 96孔高通量同步检测野生型、十余种单/双基因工程酵母，一次性完成多组生物学平行，消除分批培养温度、溶氧误差。
2. 全程连续采集OD600，完整记录延滞、对数、稳定期，精准对比各改造菌株生长动力学差异。
3. 直观证明苹果酸代谢外源基因导入不会抑制酵母生长，为工程菌株工业适用性提供核心生长数据支撑。
4. 恒温统一培养环境，浊度检测重复性优于人工单点分光测定。
5. 输出标准化生长时序图作为菌株安全性、发酵稳定性核心佐证图表。
6. 该高通量体系可标准化用于酵母代谢工程改造株生长性能批量初筛。