The influence of nutrients on biofilm formation of an ST87 strain of Listeria monocytogenes
营养条件对ST87型单核细胞增生李斯特菌生物膜形成的影响
论文来源：LWT - Food Science and Technology，2024年第191卷，文章编号115658，DOI：10.1016/j.lwt.2023.115658
一、摘要内容总结
ST87是我国食品与临床检出率最高的单增李斯特菌序列型之一，耐食品加工环境、致病风险高，易在设备表面形成生物膜引发交叉污染。本研究以304不锈钢为附着载体，模拟富营养、营养限制两类培养基（稀释TSB、牛肉汁、蔬菜汁），在15℃、25℃下探究营养组分对ST87浮游菌生长、生物膜形成及胞外聚合物（EPS）的调控规律。结果表明：富营养环境浮游菌增殖更快，但营养匮乏条件会加速生物膜生成；稀释蔬菜汁体系生物活菌量最高，所有食品模拟基质中生物膜载量均＞2 log CFU/cm²；生物膜活菌数量变化趋势与胞外蛋白高度同步，胞外多糖、eDNA受营养浓度调控；培养基蛋白、脂肪、总糖含量与EPS分泌显著负相关，pH与胞外多糖呈正相关。证实营养胁迫会刺激ST87大量合成胞外基质、强化生物膜定植，肉类、蔬菜加工残留汁液均存在持续污染风险。
二、关键词
单核细胞增生李斯特菌；ST87；生物膜；营养胁迫；胞外聚合物EPS；不锈钢载体；食品基质
三、研究目的
1. 对比标准菌株ATCC19112与本土ST87菌株在不同营养、温度下的生物膜形成能力，明确ST87成膜优势。
2. 测定富营养/稀释营养肉汤、牛肉汁、蔬菜汁中浮游菌生长动力学，分析营养对菌体增殖的影响。
3. 15℃、25℃恒温培养，定量各类食品模拟基质中不锈钢表面生物膜活菌动态变化。
4. 分时段检测生物膜胞外蛋白、多糖、eDNA含量，建立EPS组分与生物量关联规律。
5. 检测各培养基营养（蛋白/脂肪/总灰分/总糖/pH）指标，进行斯皮尔曼相关性分析，明确调控生物膜关键营养因子。
6. 从食品加工场景角度，解析肉、蔬残渣诱发李斯特菌生物膜的风险机制。
四、研究思路
1. 培养基制备：配置TSB-YE富营养、100倍稀释DTSB-YE限营养肉汤；制备牛肉原汁BB、稀释DB、蔬菜原汁VB、稀释DV六种食品模拟基质，国标测定基础营养与pH。
2. 载体预处理：304不锈钢片脱脂高压灭菌，作为生物膜附着载体。
3. 浮游菌生长测定：Bioscreen高通量仪25℃连续72 h监测OD600，获取生长曲线。
4. 生物膜培养与计数：不锈钢片浸泡菌液，15/25℃培养10 d，冲洗脱附菌体梯度稀释平板计数，得到单位面积活菌数。
5. EPS提取定量：超声裂解生物膜，离心过滤分离基质；苯酚-硫酸法测多糖、Bradford法测蛋白、分光光度法测eDNA。
6. 统计分析：单因素方差、Tukey多重比较，Spearman相关性分析营养与EPS关联，GraphPad绘图。
五、研究亮点
1. 聚焦国内高致病流行ST87菌株，对比标准株证实其生物膜形成能力更强，贴合国内食品污染真实风险。
2. 模拟牛肉、蔬菜两类加工残渣基质，更贴近餐饮、生鲜车间真实残留污染场景。
3. 明确“营养抑制浮游生长、反而促进生物膜定植”的胁迫适应机制，解释清洁不彻底的设备长期带菌原因。
4. 建立定量关联：胞外蛋白是反映生物膜丰度核心标志物，多糖、eDNA受基质酸碱度调控。
5. 完整量化基质营养指标与EPS分泌正负相关关系，为食品车间清洗消毒提供理论依据。
6. 采用Bioscreen高通量系统批量完成多营养、多重复浮游菌生长检测，试验数据重复性更高。
六、可延伸的方向
1. 探究不同食品消毒剂对营养胁迫下成熟生物膜的清除效果。
2. 转录组测序解析ST87营养胁迫下成膜、EPS合成调控基因。
3. 拓展不同加工不锈钢材质、塑料接触面，对比成膜差异。
4. 模拟冷链低温长期货架，追踪蔬菜/肉混合基质生物膜动态。
5. 开发基于营养调控的车间预处理抑膜方案。
6. 对比国内其他主流ST9型李斯特菌的营养适应差异。
七、测量的数据、配套图表与对应研究价值
1. 15℃、25℃下TSB/稀释TSB中ST87与ATCC19112生物活菌时序数据，配套图1；证明ST87成膜峰值活菌量显著高于标准株，低温仅减慢成膜速度、不降低最大载菌量。
2. 牛肉、原汁/稀释蔬菜汁10天生物膜活菌变化，配套图2；稀释蔬汁生物膜活菌峰值最高，食品稀释残留体系污染风险更高。
3. 25℃六种培养基72 h浮游菌OD生长曲线，配套图3；富营养肉汤浮游菌生长速率远高于食品汁液，稀释基质菌体增殖受明显抑制。
4. 不同培养时间EPS蛋白、多糖、eDNA定量柱状图，配套图4；营养稀释组三类胞外基质产量显著提升，稀释蔬汁多糖、eDNA积累量最高。
5. 三类基质生物活菌与胞外蛋白同步变化对比图，配套图5；营养胁迫下生物膜数量与胞外蛋白变化趋势完全匹配，蛋白可作为成膜量化指标。
6. 营养组分、pH与EPS相关性热图，配套图6；直观展示蛋白/脂肪/总糖对EPS的负调控、pH对多糖的正向调控规律，明确核心影响因子。
7. 六种培养基理化营养参数表1；为后续基质变量试验提供基础理化数据支撑。
八、得出的结论
1. 本土流行ST87型单增李斯特菌成膜能力显著强于标准株ATCC19112，15℃、25℃均可在不锈钢表面形成稳定生物膜，低温仅延缓成型速率，不降低最高载菌量。
2. 富营养环境利于浮游菌快速增殖，营养限制（稀释肉/蔬菜汁液）会触发菌株胁迫应答，显著加速、提升生物膜生成量，所有食品模拟基质生物膜活菌均高于2 log CFU/cm²。
3. 营养匮乏条件下菌株大量分泌胞外聚合物；生物膜活菌动态变化与胞外蛋白高度同步，多糖、eDNA含量随基质稀释、pH升高而上升。
4. 培养基蛋白、脂肪、总糖含量越高，EPS合成越少；基质pH越高，胞外多糖分泌越多，灰分、脂肪与eDNA呈显著负相关。
5. 生鲜加工设备残留稀释肉类、蔬菜汁液是ST87生物膜持续滋生高风险环境，常规冲洗难以消除菌体附着，易造成食品交叉污染。
6. 控制设备表面营养残留、调控接触面酸碱度，可有效抑制ST87胞外基质分泌、降低生物膜形成风险。
九、芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据的研究意义
1. 96孔蜂窝板一次性设置6种培养基、多生物学重复，消除分批培养温度、溶氧带来系统误差。
2. 72 h连续每间隔自动采集OD600，完整记录延滞期、对数、稳定期，精准对比富/限营养体系浮游菌生长速率差异。
3. 直观区分“富营养促浮游、寡营养抑浮游但促生物膜”双重表型，为核心胁迫适应论点提供连续定量生长证据。
4. 全程恒温振荡统一培养环境，浊度检测重复性远优于人工单点分光测定。
5. 输出标准化生长曲线作为全文浮游菌生长核心支撑图表。
6. 该高通量体系可标准化用于不同食品基质、营养梯度致病菌生长快速筛选。