Anti-Biofilm Effects of Z102-E of Lactiplantibacillus plantarum against Listeria monocytogenes and the Mechanism Revealed by Transcriptomic Analysis
植物乳杆菌纯化产物Z102-E对单增李斯特菌的抗生物膜效应及转录组解析机制
论文来源：Foods，2024年第13卷，文章编号2495，DOI：10.3390/foods13162495
一、摘要内容总结
单增李斯特菌是高致死食源性致病菌，易在食品设备表面形成生物膜，常规化学消毒剂易诱导耐药。本研究从潮汕发酵豆制品分离植物乳杆菌Z102，经萃取、凝胶层析、半制备HPLC纯化得到活性肽Z102-E（氨基酸序列TGVWEVK）。以亚抑菌浓度（sub-MIC）Z102-E开展体外试验，结果显示该物质可剂量依赖性抑制单增李斯特菌生长、菌体自聚集、表面疏水性、糖利用、鞭毛运动、AI-2群体感应信号、胞外多糖与胞外蛋白合成，大幅阻断生物膜生成，同时对成熟生物膜具备清除能力；倒置荧光显微镜直观证实处理后生物膜稀疏、活菌减少。转录组测序共筛选331个差异基因，117个上调、214个下调，通路富集显示Z102-E抑制菌体糖转运、鞭毛合成、群体感应、二元调控系统相关基因，从代谢、运动、信号多维度抑制生物膜发育，可作为食品天然抗致病菌生物保鲜原料。
二、关键词
植物乳杆菌；活性肽Z102-E；单增李斯特菌；抗生物膜；群体感应AI-2；转录组；胞外聚合物EPS
三、研究目的
1. 分离纯化植物乳杆菌发酵活性组分Z102-E，鉴定分子结构并测定对单增李斯特菌MIC。
2. 梯度亚MIC浓度处理，系统检测Z102-E对细菌增殖、粘附相关表型（自聚集、疏水性、运动）的影响。
3. 探究Z102-E对AI-2信号、生物膜胞外多糖/蛋白、新生及成熟生物膜的抑制清除效果。
4. 荧光显微观察生物膜活菌与胞外基质形态变化，直观验证抗生物膜作用。
5. 转录组测序筛选差异基因，GO、KEGG富集解析Z102-E抗生物膜分子调控通路。
6. 完整阐明植物乳源活性肽控李斯特菌生物膜机制，为食品绿色抑菌剂开发提供理论支撑。
四、研究思路
1. 菌株培养与产物纯化：MRS培养植物乳杆菌Z102，乙酸乙酯萃取上清，LH-20凝胶+制备型HPLC纯化，LC-MS确定Z102-E多肽序列。
2. MIC与生长动力学：Bioscreen高通量仪测定不同浓度Z102-E下菌液OD600，确定MIC=6.4 mg/mL，选取0.8/1.6/3.2 mg/mL亚MIC开展后续试验。
3. 菌体粘附特性测定：静置法测自聚集率、二甲苯法测表面疏水性、半固体穿刺法观测鞭毛运动。
4. 碳源利用试验：6种单一糖培养基加Z102-E，24 h测OD评估糖代谢抑制。
5. 群体感应检测：哈维氏弧菌BB170生物发光法定量AI-2信号分子含量。
6. 生物膜定量：结晶紫染色测24/48 h新生生物；高浓度Z102-E处理成熟膜，测定4/24/48 h清除率；苯酚硫酸、Bradford法分别定量胞外多糖、蛋白。
7. 微观观测：活死菌、伴刀豆球蛋白荧光双染，倒置荧光显微镜观察生物膜结构。
8. 转录组分析：对照组、0.8 mg/mL处理组提取RNA，NovaSeq测序，DESeq2筛选差异基因，GO/KEGG通路富集。
9. 统计学：SPSS、GraphPad绘图，三组生物学重复，方差分析比较组间差异。
五、研究亮点
1. 首次纯化鉴定植物乳杆菌源活性肽Z102-E，完整验证其同时抑制新生、清除成熟单增李斯特菌生物膜双重活性。
2. 多表型完整评价体系：覆盖生长、粘附、运动、碳代谢、群体感应、胞外基质六大生物膜形成关键环节。
3. 作用模式安全：采用亚抑菌浓度，仅抑制毒力与生物膜、不杀灭细菌，不易诱导菌株耐药突变。
4. 转录组大数据完整解析调控网络：靶向PTS糖转运、鞭毛组装、二元群体感应三大核心通路。
5. 天然乳酸菌来源活性肽，食品级安全，无化学残留，适配生鲜、加工食品设备污染防控。
6. 建立“乳酸菌代谢物纯化-体外表型验证-荧光微观观测-转录组分子机制”标准化抗生物膜研究流程。
六、可延伸的方向
1. 优化Z102-E规模化发酵、纯化工艺，降低生产成本。
2. 多肽定点改造，提升抑菌、抑膜活性。
3. Z102-E与有机酸、植物精油复配，构建协同防腐体系。
4. 生鲜肉类、乳制品货架期模拟试验，验证实际控菌效果。
5. 体内动物试验，评估对李斯特菌侵染肠道的阻断能力。
6. 蛋白组、代谢组联合多组学，深度挖掘完整调控网络。
七、测量数据、配套图表与对应研究价值
1. 不同浓度Z102-E菌体OD600生长时序数据，配套图1；确定MIC为6.4 mg/mL，直观证明亚MIC剂量仅阻滞生长而非杀菌，划定后续试验安全作用浓度区间。
2. 自聚集率、菌体表面疏水性定量数值，配套图2；3.2 mg/mL处理后自聚集率仅7.31%、疏水性17.29%，量化Z102-E削弱细菌界面粘附能力，解释生物膜初期阻断机制。
3. 葡萄糖、半乳糖等6种碳源24 h生长曲线，配套图3；随多肽浓度升高菌体糖利用显著受阻，证明多肽抑制碳转运，切断生物膜物质供给。
4. 半固体运动扩散直径观测结果，配套图4；Z102-E浓度越高菌体迁移能力越弱，验证鞭毛运动抑制作用。
5. 24 h、48 h新生生物膜抑制率统计，配套图5；3.2 mg/mL处理48 h抑膜率达65.97%，直观呈现剂量依赖性抑膜效果。
6. 成熟生物4/24/48 h清除率数据，配套图6；25.6 mg/mL处理48 h清除率超60%，证明多肽可降解已成型致密生物膜。
7. AI-2、胞外多糖、胞外蛋白抑制率柱状数据，配套图7；3.2 mg/mL下AI-2抑制82.44%、多糖抑制75.55%，明确多肽同时阻断群体感应与膜骨架合成。
8. 活死菌+胞外多糖荧光显微图像，配套图8；对照组生物膜致密完整，处理组膜碎片化、活菌数量大幅下降，提供直观微观证据。
9. 差异基因火山图、聚类热图，配套图9、图10；筛选得到331个显著差异基因，直观体现Z102-E全局转录抑制效应。
10. GO功能富集、KEGG通路富集柱状图，配套图11；明确差异基因集中于糖转运、鞭毛组装、二元调控、抗生素抗性通路，完整搭建分子作用模型。
八、得出的结论
1. 从植物乳杆菌Z102分离纯化得到多肽Z102-E，对单增李斯特菌MIC=6.4 mg/mL，亚抑菌浓度即可显著抑制生物膜形成，高浓度可清除成熟生物膜。
2. Z102-E通过多重途径阻断生物膜前期定植：降低菌体自聚集、表面疏水性，抑制鞭毛运动，阻断各类碳水化合物摄取。
3. Z102-E大幅下调AI-2群体感应信号，抑制生物膜核心组分胞外多糖、胞外蛋白合成，瓦解生物膜三维骨架。
4. 转录组结果显示Z102-E造成331个基因显著差异表达，大量PTS糖转运、鞭毛合成、二元调控系统、毒力相关基因下调，从转录层面阻断生物膜发育通路。
5. 植物乳源多肽Z102-E天然安全，兼具抑制新生、降解成熟李斯特菌生物膜双重功能，是极具潜力的食品工业天然抗污染生物制剂。
6. 本研究仅完成体外机制验证，后续需结合食品基质、动物感染试验进一步评估实际应用效果。
九、芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据的研究意义
1. 96孔蜂窝板一次性设置多梯度多肽浓度、空白对照组，同步生物学重复，消除分次培养温度、溶氧带来系统误差。
2. 仪器连续24 h每10 min自动采集OD600浊度，完整记录菌株延滞期、对数生长期变化，精准量化不同浓度Z102-E对增殖的阻滞强弱。
3. 清晰区分杀菌浓度与亚抑菌作用浓度，为后续不诱导耐药的抑膜试验提供精准浓度筛选依据。
4. 全程恒温稳定振荡，统一培养环境，浊度检测重复性、统计学可信度优于人工单点分光检测。
5. 直接输出标准化生长时序折线图（图1）作为全文基础定量支撑图表。
6. 该高通量检测体系可标准化用于乳酸菌代谢物、天然提取物抑菌抑膜活性批量快速筛选。