Anti-biofilm and anti-virulence potential of cell free supernatant of Akkermansia muciniphila against Salmonella
嗜黏阿克曼菌无细胞上清液对鼠伤寒沙门氏菌的抗生物膜、抗毒力作用潜力
期刊：Food Science and Human Wellness，2024，第13卷
一、摘要内容总结
嗜黏阿克曼菌是哺乳动物肠道共生菌，现有研究多聚焦其调节代谢疾病功能，该菌分泌物抑制食源性致病菌的作用尚不清晰。本研究提取嗜黏阿克曼菌无细胞上清液（CFS），以两株鼠伤寒沙门氏菌SL1344、14028为对象开展体外试验；结果显示CFS可剂量依赖性延缓沙门氏菌增殖、抑制运动能力，降低菌体疏水性与自聚集能力，显著阻碍生物膜生成。CFS处理后的沙门氏菌对Caco-2肠上皮细胞黏附、入侵能力大幅下降，巨噬细胞内存活增殖水平显著降低。热、蛋白酶处理不破坏CFS抑菌活性，但中和pH后活性完全丧失；GC-MS证实CFS富含乙酸、丙酸等短链脂肪酸，UHPLC-MS代谢组鉴定出多种有机酸类活性代谢物。该上清液依靠有机酸发挥抑菌、抗毒力功效，具备食品行业防控沙门氏菌污染的应用潜力。
二、关键词
嗜黏阿克曼菌；无细胞上清液CFS；鼠伤寒沙门氏菌；生物膜；运动性；短链脂肪酸；细胞黏附；毒力因子
三、研究目的
1. 探究嗜黏阿克曼菌无细胞上清液（CFS）对两株鼠伤寒沙门氏菌生长增殖的抑制效果，明确浓度梯度差异。
2. 评价CFS对沙门氏菌运动、菌体疏水性、自聚集三大生物膜前期关键性状的调控作用。
3. 定量检测不同培养时长下CFS对沙门氏菌生物膜形成的抑制效果，结合电镜、活死荧光染色直观观察膜结构变化。
4. 验证CFS处理后沙门氏菌对人结肠Caco-2细胞黏附、入侵能力的改变，以及在RAW264.7巨噬细胞内的存活差异。
5. 通过高温、酸碱、蛋白酶处理CFS，解析发挥活性的核心物质理化特性。
6. GC-MS定量短链脂肪酸含量，UHPLC-MS代谢组全面解析CFS代谢组分，明确抗毒力活性物质类别。
四、研究思路
1. 菌株培养：厌氧培养嗜黏阿克曼菌，离心过滤获得无菌CFS；两株鼠伤寒沙门氏菌活化调至统一菌液浓度备用。
2. 生长动力学检测：Bioscreen高通量仪37℃连续36h测定不同体积分数（0%/25%/50%/75%/100%）CFS处理组OD600，绘制生长曲线。
3. 运动、疏水性、自聚集试验：半固体平板测量扩散圈判定运动能力；二甲苯分层法计算菌体表面疏水性；静置分层法计算自聚集率。
4. 生物膜定量与表征：24/48/72h结晶紫染色测OD570；扫描电镜观察膜微观结构；SYTO9/PI双荧光染色区分活死菌。
5. 细胞侵染试验：分别开展Caco-2黏附、入侵试验，RAW264.7巨噬细胞胞内存活计数，对比有无CFS处理的活菌数量差异，同时设置pH校正对照组排除酸度干扰。
6. CFS稳定性试验：分别高温、强酸强碱、多种蛋白酶处理CFS后重新测定抑菌活性，判断活性物质理化特征。
7. 代谢物分析：GC-MS定量乙酸、丙酸短链脂肪酸；UHPLC-MS非靶向代谢组鉴定全部差异代谢物，开展PLS-DA、通路富集分析。
8. 单一短链脂肪酸验证：培养基添加对应浓度乙酸、丙酸，单独验证其抑菌效果，佐证CFS核心功能组分。
9. 全部试验设置三次生物学重复，采用单因素方差分析完成统计学检验。
五、研究亮点
1. 首次系统证实嗜黏阿克曼菌上清液可全方位抑制沙门氏菌全套毒力相关性状（生长、运动、聚集、生物膜、细胞侵染），拓展该益生菌食品抑菌应用方向。
2. 明确CFS活性物质核心特征：耐热、耐蛋白酶降解，但依赖酸性环境，中和pH后完全失效，锁定有机酸为功能核心。
3. 多维度可视化证据支撑结论：生长曲线定量增殖抑制、电镜直观生物膜稀疏化、荧光染色证明膜内活菌大幅减少。
4. 细胞层面证实CFS可阻断沙门氏菌上皮定植与胞内存活，从感染前期、胞内增殖双层阻断侵染过程。
5. 代谢组+靶向短链脂肪酸定量双重验证，乙酸、丙酸是上清主要抑菌组分，单独添加即可重现抑制效果。
6. 不依赖活菌、仅使用发酵上清的模式，规避益生菌储运活菌失活问题，适合食品加工体系防腐开发。
六、可延伸的方向
1. 分离纯化CFS中单一有机酸单体，分别定量各组分单独、复配协同抑菌强度。
2. 开展生鲜肉类、乳制品实际食品基质贮藏试验，验证CFS真实防腐保鲜效果。
3. 优化发酵工艺提升阿克曼菌产短链脂肪酸产量，降低工业化制备成本。
4. 开发CFS复合可食涂膜、浸泡保鲜剂，适配不同生鲜食品加工场景。
5. 拓展CFS对李斯特菌、副溶弧菌等多种食源性致病菌的广谱抑制能力。
6. 动物体内试验验证CFS口服后对肠道沙门氏菌感染的防护作用。
七、测量数据、配套图表与对应研究价值
1. 梯度CFS（0%~100%体积分数）处理沙门氏菌36h连续OD600浊度数据，配套图1生长时序曲线；100%CFS处理36h后SL1344、14028菌株OD显著低于空白组，直观证明CFS剂量依赖性延缓细菌增殖，利用Bioscreen高通量批量消除分次培养误差，精准量化生长抑制程度。
2. 半固体平板扩散圈直径、相对运动率统计数据，配套图2平板实拍与定量柱状；100%CFS可分别降低两株菌运动能力48.15%、12.25%，证实上清抑制鞭毛运动，阻断生物膜初期定植关键步骤。
3. 二甲苯分层法疏水性、静置分层自聚集率计算数值，配套图3两组指标柱状；随CFS浓度提升菌体疏水性、自聚集能力持续下降，解释生物膜难以成型的表层细胞特性改变机制。
4. 24/48/72h结晶紫OD570生物膜定量、扫描电镜微观形貌、活死荧光染色图像，配套图4定量柱状、电镜图、荧光图；CFS处理后生物膜总量显著下降，膜结构松散、活菌数量大幅减少，提供宏观定量+微观影像双重抗生物膜证据。
4. Caco-2细胞黏附、入侵活菌计数，RAW264.7巨噬细胞1h/24h胞内菌落数，配套图5细胞试验图表；100%CFS可大幅降低沙门氏菌上皮附着与胞内增殖能力，且抑制作用并非单纯pH导致，揭示CFS阻断宿主侵染的毒力抑制功能。
5. 高温、酸碱、蛋白酶处理后上清抑菌OD检测结果，配套图6各组活性对比柱状；37~121℃、胃蛋白酶等处理活性无明显下降，仅中和pH后抑菌作用消失，确定活性成分为酸性小分子有机酸，排除蛋白、多糖类功能物质。
6. GC-MS测得CFS乙酸104.72 μg/mL、丙酸218.56 μg，配套图7短链脂肪酸抑菌曲线；单独添加同等浓度乙酸、丙酸即可重现抑制效果，直接证明两类短链脂肪酸是上清核心活性物质。
7. UHPLC-MS正负离子模式代谢组检测共919种代谢物，配套图8 PLS-DA、聚类热图、HMDB分类、通路富集图；CFS显著富集各类有机酸，代谢差异集中于糖、有机酸代谢通路，完整解析上清代谢特征，挖掘潜在协同抑菌次生代谢物。
八、得出的结论
1. 嗜黏阿克曼菌无细胞上清液CFS可剂量依赖性抑制两株鼠伤寒沙门氏菌生长，同时降低菌体运动、疏水性、自聚集能力，显著抑制生物膜形成。
2. CFS能够削弱沙门氏菌对肠上皮细胞的黏附与入侵能力，降低病原菌在巨噬细胞内存活增殖水平，全方位抑制其侵染毒力。
3. CFS抑菌活性耐受高温、多种蛋白酶处理，但pH中和后完全丧失功能，说明酸性小分子有机酸是发挥作用的核心组分。
4. 上清富含乙酸、丙酸两类短链脂肪酸，单独添加该类物质可重现抑菌、抑毒效果，是CFS核心活性代谢产物。
5. 嗜黏阿克曼菌发酵上清液具备无细胞、稳定性强、抗沙门氏菌增殖与毒力的优势，可开发为食品天然防腐添加剂，用于防控食源性沙门氏菌污染。
九、芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据的研究意义
1. 96孔高通量同步设置0%/25%/50%/75%/100%五组CFS梯度，一次性完成三次生物学平行，避免分批培养温度、溶氧带来系统误差。
2. 仪器每1小时自动连续采集36h全程OD600数值，完整捕捉延滞期、对数、稳定期生长差异，精准量化不同浓度CFS对沙门氏菌增殖延缓效果。
3. 连续时序数据直观区分低、高浓度CFS梯度抑制强弱，为“剂量依赖性抑菌”核心论点提供连续动态定量证据，区别于单点分光检测的片面性。
4. 全程恒温稳定振荡，统一菌体培养环境，浊度检测重复性、统计学可信度大幅提升。
5. 直接输出标准化生长曲线图（图1）作为全文基础抑菌核心图表，直观呈现CFS对沙门氏菌生长阻滞效果。
6. 该高通量检测流程可标准化用于益生菌上清、天然提取物抑菌活性批量初筛，大幅缩短体外抑菌试验研发周期。