全自动生长曲线分析仪

Effects of Heterologous Expression of Genes Related L–Malic acid Metabolism in Saccharomyces uvarum on Flavor Substances Production in Wine

异源表达苹果酸代谢相关基因对葡萄汁酵母产葡萄酒风味物质的影响

期刊：Foods，2024，13(13):2038，DOI：10.3390/foods13132038

一、摘要

传统葡萄酒酿造需分两步，先酵母酒精发酵，再乳酸菌苹果酸乳酸发酵（MLF）；乳酸菌在高酒精度、低pH、高SO₂葡萄汁环境生长受阻，易出现发酵停滞，还会生成生物胺等不良副产物。葡萄汁酵母产香表现优于酿酒酵母，但天然转运、降解苹果的能力不足。本研究将裂殖酵母MAE1、MAE2，乳球菌/植物乳杆菌/酒球菌来源mleS、mleA基因分别单基因、双基因串联导入野生工业葡萄汁酵母WY1，构建多株工程菌株；模拟葡萄汁体系实现酒精发酵与苹果酸降解同步进行，系统检测有机酸、高级醇、酯类香气物质。实验结果显示MAE1与乳球菌mleS共表达菌株WYm1SN综合性能最优，可将酒中苹果酸降至1 g/L行业标准以内，同时降低异丁醇、异戊醇等刺激性杂醇，提升柔和乳酸乙酯；所有改造菌株生长、发酵能力与原始菌株无明显差异，可一步完成发酵，省去乳酸菌二段发酵，解决多项工业生产难题。

二、中文关键词

葡萄汁酵母；苹果酸代谢；苹果酸乳酸发酵；异源基因表达；高级醇；葡萄酒香气；代谢工程；Bioscreen高通量生长检测

三、研究目的

1. 分别构建单基因、双基因重组葡萄汁酵母，对比苹果酸通透酶、苹果酸酶、苹果酸乳酸酶单独作用与协同作用下降解苹果酸的效率；

2. 解析不同基因组合对丙酮酸、乳酸中间代谢物流向的调控规律；

3. 定量各组菌株高级醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯香气组分含量变化，阐明苹果酸代谢通路改变对葡萄酒风味的调控机理；

4. 测定全部工程菌生长动力学、发酵CO₂失重、残糖、酒精度指标，验证基因改造不会损伤菌株基础发酵性能；

5. 从降酸效果、风味平衡、发酵稳定性三个维度筛选最优工业候选菌株；

6. 建立一步式葡萄酒降酸酵母改造方案，替代传统乳酸菌二段发酵工艺。

四、研究思路

1. 载体构建与菌株转化：使用PGK强启动子构建单基因、双基因串联表达载体，锂醋酸转化法导入野生WY1，获得二十余株重组菌株；

2. 基因表达验证：RT-qPCR定量检测各外源基因转录水平，确认基因在酵母体内稳定表达；

3. 菌体生长检测：采用Bioscreen高通量设备测定所有菌株YEPD培养基完整生长曲线；

4. 模拟葡萄汁发酵：统一初始糖度与pH，25℃恒温发酵，定时记录CO₂失重反映发酵进程；

5. 产物定量分析：高效液相色谱检测苹果酸、乳酸、丙酮酸，气相色谱测定各类高级醇与酯类；

6. 代谢通路解析：结合文中图8的ILV、Ehrlich高级醇合成通路，解释苹果酸代谢重塑碳流的分子机制；

7. 多指标综合评估，筛选兼具高效降酸、均衡香气的优势菌株。

五、研究亮点

1. 仅单独表达转运酶或降解酶无法达标，MAE1苹果酸通透酶搭配乳球菌mleS苹果酸乳酸酶双基因共表达存在显著协同效果，该结论来自文中图3、图6、图7有机酸检测结果；

2. mleS催化苹果酸转化为乳酸，减少丙酮酸流入杂醇合成途径，降低刺鼻异丁醇、异戊醇，同时生成乳酸乙酯，风味数据来源于文中表3；

3. 单独表达MAE2会提升胞内丙酮酸供给，使乙酸乙酯、异戊醇小幅上升，香气轮廓发生改变，相关数据见文中表3；

4. 全部改造菌株生长曲线与原始株基本重合（文中图9），发酵周期、产酒精、残糖无显著差异（文中表4、图10），基因改造无发酵缺陷；

5. 实现酒精发酵、苹果酸乳酸同步一步发酵，规避MLF停滞、生物胺生成等工业痛点；

6. 搭建“Bioscreen生长初筛-模拟汁发酵-色谱风味定量”标准化酵母筛选评价流程。

六、可延伸的研究方向

1. 共表达MleR调控基因，提升mleS转录强度，强化极端葡萄汁环境下降酸能力；

2. 叠加杂醇调控基因，定向开发专属香型工程酵母；

3. 真实葡萄原料开展中试发酵，进行感官品评验证实际酿酒效果；

4. 构建基因组整合型菌株，解决质粒传代丢失问题，提升工业长期遗传稳定性；

5. 测试高二氧化硫、低温酿造条件下菌株降酸稳定性；

6. 将本改造策略拓展应用于其他非酿酒酵母菌种。

七、测量数据、对应图表与研究意义

1. RT-qPCR定量柱状图（文中图2）：所有外源基因在重组酵母内均显著上调，载体表达系统工作有效；

2. 有机酸定量柱状图（文中图3、图4、图6、图7）：单基因改造菌株降酸幅度有限，WYm1SN菌株苹果酸含量低至1.098 g/L，乳酸大量积累；

3. 风味物质定量数据（文中表3）：WYm1SN异丁醇、异戊醇含量显著下降，乳酸乙酯大幅提升；

4. Bioscreen菌体生长曲线图（文中图9）：所有重组菌生长动力学与野生WY1高度一致，基因改造不造成生长损伤；

5. 发酵累计CO₂失重曲线（文中图10）：各组菌株发酵周期、产气总量无明显区别，发酵性能稳定；

6. 高级醇合成代谢通路图（文中图8）：直观展示苹果酸代谢改变丙酮酸分流路径，调控ILV、Ehrlich通路香气物质合成；

7. 发酵性能统计表（文中表4）：对比所有菌株CO₂失重、酒精度、残糖，确定WYm1SN为综合性能最优工业候选菌株。

八、整体研究结论

1. 野生葡萄汁酵母自身转运、降解苹果酸能力不足，仅单基因改造无法达到葡萄酒苹果酸≤1 g/L的行业标准，结论依托文中图3、图4有机酸检测数据；

2. 裂殖酵母MAE1与乳球菌mleS双基因共表达具备协同降酸作用，是最优改造组合，相关结果来自文中图7；

3. 苹果酸代谢重塑细胞碳代谢流向，减少刺激性高级醇生成、增加柔和乳酸乙酯，风味变化依据文中表3风味检测数据；

4. 全部工程菌株生长、产酒精、发酵周期与野生株无显著差异，生长数据见文中图9，发酵指标见文中表4、图10；

5. WYm1SN菌株可同步完成酒精发酵与苹果酸乳酸发酵，省去乳酸菌接种步骤，规避二段发酵带来的各类生产缺陷；

6. 本代谢工程改造方案可用于开发低酸度、果香协调的专用工业葡萄酒酵母。

九、芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据详细研究意义

1. 96孔高通量微孔板同步完成二十余株重组酵母平行生长测试，所有生长时序数据对应文中图9；

2. 统一恒温振荡培养条件，消除摇瓶分批、温度带来的实验误差，菌株生长速率对比结果客观可靠；

3. 提前筛选并剔除生长缺陷改造菌株，大幅减少后续葡萄汁发酵实验工作量；

4. 高通量生长数据与文中表3风味、图3/7有机酸检测结果形成完整证据链，证明风味差异源于代谢重塑而非菌体生长异常；

5. 微量培养体系节约酵母菌种与培养基原料，适合酵母基因改造大规模前置生理筛选；

6. 标准化OD值定量检测流程，可作为酿酒基因改造菌株生理性能通用前置评价手段。