Research on Engineering the Saccharomyces uvarum for Constructing a High Efficiency to Degrade Malic Acid and Low Yield of Diacetyl Biosynthesis Pathway
工程化葡萄汁酵母用于构建高效降苹果酸、低双乙酰生物合成通路研究
论文来源：Foods，2024，13(19):3161；DOI：10.3390/foods1319316；
一、摘要内容总结
葡萄酒酿造分为酵母酒精发酵与乳酸菌苹果酸乳酸发酵两步，乳酸菌发酵极易产生过量双乙酰，带来黄油异味，破坏酒体风味；现有单一改造降双乙酰或降苹果酸菌株无法兼顾两项需求。本研究以工业葡萄汁酵母WY1为底盘，组合改造双乙酰代谢基因（ILV2/ILV6敲除、ILV3/ILV5/BDH1/BDH2过表达、植物乳源aldB异源表达）与苹果酸代谢基因（粟酒裂殖酵母mae1、乳酸乳球菌mleS共表达），构建系列联合工程菌株。发酵验证筛选出V6AmS、V635mS、V6B12mS三株最优菌株，可同步高效降解苹果酸、大幅降低双乙酰；同时调控高级醇与酯类风味物质分布，不破坏菌株基础发酵能力，解决传统分阶段发酵风味失衡问题，为葡萄酒专用工程酵母开发提供可行改造策略。
二、关键词
葡萄汁酵母、葡萄酒、双乙酰、苹果酸、代谢工程、风味物质
三、研究目的
单独改造苹果酸代谢基因会显著提升双乙酰含量，单一降双改造无法完成脱酸，因此本研究旨在通过多基因联合修饰，同步实现酵母高效降解苹果酸、低产双乙酰；解析ILV系列、BDH、aldB、mae、mle基因协同调控有机酸、双乙酰、高级醇的代谢机理；筛选发酵性能稳定、风味均衡最优工程菌株；验证改造基因对酵母生长、糖耗、乙醇产量等基础发酵指标无负面影响。
四、研究思路
采用Cre-loxP基因编辑系统，分步构建单基因修饰底盘菌：敲除ILV2/ILV6，分别过表达ILV3+ILV5、BDH1+BDH2，异源表达植物乳杆菌aldB获得低双乙酰基础菌株；在上述菌株中整合ma1、mle双脱酸基因，构建多基因联合突变株；设置纯酒精发酵、顺序发酵、共发酵三组工艺对比双乙酰生成量；利用HPLC、气相色谱检测发酵液苹果酸、乳酸、双乙酰、乙偶姻、2,3-丁二醇、高级醇与酯含量；采用Bioscreen全自动生长仪测定各菌株生长曲线，称重法记录发酵CO₂失重，对比原始菌与工程菌发酵动力学；统计分析各基因组合对风味物质的协同调控效应，筛选综合最优菌株。
五、研究亮点
首次将双乙酰抑制通路与苹果酸降解通路整合至同一葡萄汁酵母，实现单菌完成酒精发酵+苹果酸降解，省去乳酸菌发酵步骤；明确ILV6敲除搭配mae1/mleS共表达组合综合效果最优，苹果酸降至1.2 g/L以下，双乙酰降幅超60%；改造后菌株正丙醇适度上升、异丁醇与异戊醇同步降低，乳酸乙酯显著积累，酒体风味更协调；部分菌株生长、产乙醇能力与野生株无差异，具备工业化发酵适配性；完整阐明丙酮酸分流调控逻辑：阻断α-乙酰乳酸生成、加速其转化为乙偶姻，同时促进苹果酸转运降解，两条代谢通路协同平衡碳流。
六、可延伸的方向
开展50–500 L中试发酵与感官品评，验证菌株实际酿酒风味；结合转录组、代谢组解析多基因互作全局调控网络；定点优化启动子强度，进一步提升脱酸效率、压低双乙酰；改造菌株适配高糖、低pH难发酵葡萄汁；拓展该多基因编辑思路应用于啤酒、果酒专用酵母构建。
七、测量的数据、对应图表及研究意义
1. 三种发酵工艺下野生与单修饰菌株双乙酰含量柱状图（图3）；意义：证实乳酸菌参与的顺序、共发酵会大幅升高双乙酰，仅酵母单发酵双乙酰更低，但单独脱酸菌株会伴随双乙酰上升。
2. 各类单脱酸菌株双乙酰、乙偶姻与丁二醇定量图（图4、5）；意义：单独表达mae/mle会提升丙酮酸流向双乙酰通路，明确两条代谢通路存在碳流竞争。
3. 多基因联合菌株苹果酸、乳酸含量对比（图6）；意义：V6系列改造株苹果酸降解效率远优于V2系列，乳酸同步大量生成，脱酸效果显著。
4. 高级醇、乙酸/乳酸乙酯检测结果图（图7）；意义：联合改造可定向优化杂醇组分，提升果香类乳酸乙酯含量，改善酒体风味。
5. 菌株生长OD动态曲线（图8）；意义：V6AmS、V635mS、V6B12mS生长趋势与野生WY1基本一致，遗传改造不损伤菌体增殖。
6. 发酵全程CO₂失重曲线（图9、表3）；意义：最优三组菌株残糖、乙醇、酸度指标与野生株接近，发酵速率稳定，具备工业应用基础。
7. 菌株、质粒、引物补充附表；意义：完整提供基因编辑载体与改造方案，实验可重复。
八、研究结论
单独导入苹果酸代谢基因会促使丙酮酸流向双乙酰合成，仅改造降双乙酰基因无法实现葡萄酒脱酸；通过敲除ILV6、过表达ILV3/ILV5或BDH1/BDH2、异源aldB，同时整合mae1+mleS的联合改造策略，可获得V6AmS、V635mS、V6B12mS三株优良工程葡萄汁酵母；三类菌株苹果酸可降至1.2 g/L左右，双乙酰下降52%–65%，杂醇组成优化、乳酸乙酯含量显著提升；菌株生长、产乙醇、糖消耗等核心发酵指标不受改造影响，无需乳酸菌发酵即可完成脱酸，简化酿酒工艺；该多通路协同代谢工程策略，为低异味、风味均衡葡萄酒酵母选育提供可靠方案。
九、芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据详细解读
将野生WY1与全部基因工程菌株接种YEPD培养基，30℃恒温，仪器连续自动采集OD600生长曲线，全程记录迟滞期、对数期、稳定期动态；V6系列最优菌株生长动力学与原始工业酵母无明显差异，V2系列改造株出现生长延迟、终菌量偏低，证明ILV6敲除对菌株生理负担更小；高通量平行定量生长数据快速筛选无生长缺陷的目标工程菌，提前预判发酵能力，减少摇瓶批量发酵工作量，生长数据与后期葡萄汁发酵CO₂失重结果匹配，可作为菌株发酵性能初筛标准。