An experimental target-based platform in yeast for screening Plasmodium vivax deoxyhypusine inhibitors
基于靶点的酵母筛选平台用于间日疟原虫脱氧羟腐胺合酶抑制剂筛选
论文来源：PLOS Neglected Tropical Diseases，2024年第18卷第12期，文章编号e0012690；DOI：10.1371/journal.pntd.0012690；
一、摘要内容总结
脱氧羟腐胺合酶（DHS）催化真核翻译因子eIF5A的关键翻译后修饰，该酶是疟原虫生存必需蛋白，且人源与疟原虫DHS序列结构存在明显差异，具备选择性抗疟药物开发潜力，但目前尚无靶向疟原虫的特异性DHS抑制剂。由于间日疟原虫体外持续培养体系缺失，本研究构建酵母替代遗传筛选平台，改造酿酒酵母内源DHS编码基因，分别替换为人源HsDHS或间日疟原虫PvDHS，同时敲除药物外排基因、整合荧光报告基因、采用可调控MET启动子微调DHS表达，改造后菌株对小分子抑制剂灵敏度提升约60倍。研究先基于同源建模构建两套PvDHS三维结构，对病原化合物库开展虚拟对接筛选得到9个候选分子；再利用自动化高通量酵母生长筛选，同时对400种病原盒化合物复筛，最终得到3个选择性抑制剂N2、N7、PB1。体外实验证实三种化合物可特异性降低表达PvDHS酵母的eIF5A羟腐胺修饰水平，对恶性疟原虫红内期具备抑制活性，半数有效浓度处于纳摩尔至微摩尔区间，且对人肿瘤细胞毒性极低。该酵母平台可高效筛选疟原虫选择性DHS抑制剂，也可拓展应用于其他寄生生物靶点药物挖掘。
二、关键词
间日疟原虫、脱氧羟腐胺合酶、酵母替代筛选、抗疟小分子、虚拟对接、高通量药物筛选
三、研究目的
构建可稳定表达人源/间日疟原虫DHS的基因工程酵母高通量筛选平台，解决间日疟原虫难以体外连续培养的实验瓶颈；通过同源建模与分子对接预测PvDHS潜在小分子结合配体，筛选疟原虫选择性DHS抑制剂；依托酵母生长表型与蛋白修饰水平双重验证候选分子对PvDHS的抑制特异性；评估筛选化合物对氯敏感、氯耐药恶性疟原虫的体外杀伤活性及人体细胞毒性；验证该酵母替代体系通用性，为其他寄生虫靶点药物筛选提供标准化实验方案。
四、研究思路
生物信息与结构模拟：以人源DHS晶体结构为模板搭建两套PvDHS同源四聚体模型，划分正构、别构两个结合口袋，对ChEMBL-NTD数据库数十万化合物开展高通量虚拟对接，依据结合能阈值初筛9个潜力配体；酵母菌株基因编辑：选用多重药物耐受基因敲除酵母底盘，CRISPR介导整合mCherry/Sapphire荧光标记，利用MET3启动子置换内源DYS1基因，分别构建仅表达HsDHS、PvDHS的等基因对照菌株；平台体系验证：以已知人DHS抑制剂GC7为阳性对照，优化甲硫氨酸调控浓度，使两种菌株eIF5A修饰水平持平，建立标准化生长检测流程；两轮高通量表型筛选：先对9个虚拟候选分子梯度浓度处理酵母，通过生长曲线下面积判断选择性；再对400种Pathogen Box病原化合物批量筛选，复筛阳性 hits；分子机制验证：Western blot检测化合物处理后酵母eIF5A羟腐胺修饰含量，确认靶点抑制作用；体外抗疟与毒性评价：在人红细胞培养恶性疟3D7、Dd2株测定化合物EC50，利用肝癌、乳腺癌细胞检测人体细胞IC50，评估药物安全窗口。
五、研究亮点
搭建灵敏度提升60倍的双对照酵母筛选平台，同步用人源、疟原虫DHS菌株平行筛选，快速区分靶点选择性抑制剂；首次解析PvDHS同源蛋白三维结构，区分正构、别构两类配体结合模式，为抑制剂分子改造提供结构基础；通过虚拟筛选+自动化高通量酵母表型双重筛选，获得3种全新选择性PvDHS抑制剂；候选分子N7纳摩尔级抑制耐药疟原虫，人体细胞毒性微弱，具备抗疟先导化合物开发价值；建立不依赖疟原虫体外培养的替代药物筛选体系，可推广至各类寄生生物必需蛋白抑制剂挖掘。
六、可延伸的方向
基于N2、N7、PB1与PvDHS对接相互作用，化学修饰优化分子亲和力，提升抗疟效价；开展小鼠体内疟原虫感染实验，评估化合物体内药效与代谢安全性；拓展该酵母筛选平台用于锥虫、利什曼原虫等其他寄生虫DHS抑制剂筛选；解析PvDHS-抑制剂共晶结构，明确精确结合位点；组合DHS抑制剂与现有抗疟药物，评估协同杀菌效果，应对疟原虫多重耐药问题。
七、测量的数据、对应图表及研究意义
1. 人源、酵母、间日疟DHS多序列比对图（图1）；意义：直观展示催化口袋保守残基与疟原虫特有插入序列，解释靶点选择性结构基础。
2. PvDHS两套同源四聚体模型、配体重对接验证图（附图S1-S3）；意义：证实建模可靠，确立正构、别构两个药物筛选结合口袋，给出对接筛选能量阈值标准。
3. GC7抑制剂梯度处理酵母生长曲线、eIF5A修饰定量图（图2）；意义：完成平台体系标准化验证，确定甲硫氨酸调控条件实现两种菌株修饰水平匹配。
4. 候选分子N2、N7梯度处理菌株生长定量曲线（图3）；意义：直观证明两种分子仅显著抑制PvDHS酵母生长，对人源DHS菌株无明显干扰，具备靶点选择性。
5. PB1化合物不同浓度酵母生长检测图（图4）；意义：补充第二轮化合物库筛选阳性分子的选择性表型数据。
6. 三种抑制剂处理后eIF5A羟腐胺修饰Western定量图（图5）；意义：从蛋白修饰分子层面直接证明化合物特异性抑制PvDHS酶活。
7. 恶性疟3D7、Dd2株半数抑制浓度数据表（表2）；意义：量化三种分子抗疟活性，N7对耐药虫株活性最优。
8. 补充附图S6-S12、实验菌株/质粒/引物/化合物附表；意义：完整提供全部实验原始数据、材料信息，支撑实验可重复。
八、研究结论
间日疟原虫PvDHS与人源HsDHS序列、结构存在明显差异，是安全抗疟理想靶点；本研究改造的等基因双对照酵母高通量筛选平台灵敏度大幅提升，可精准筛选疟原虫选择性DHS小分子；虚拟对接联合自动化酵母生长筛选得到N2、N7、PB1三种特异性抑制剂，均可降低PvDHS介导的eIF5A羟腐胺修饰；三种分子体外抑制氯喹敏感、耐药恶性疟原虫，N7活性达纳摩尔级别且人体细胞毒性低；该酵母替代体系规避间日疟原虫体外培养难题，适用于各类寄生虫必需酶的先导化合物高通量筛选。
九、芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据详细解读
实验将野生酵母、表达HsDHS、PvDHS的工程菌株统一稀释至标准初始OD，分装微孔板添加梯度浓度待测化合物，30℃恒温长时间培养，仪器每20分钟自动采集OD与荧光信号，通过生长曲线下面积AUC量化菌株增殖程度，设置四组生物学重复、溶剂空白对照。GC7阳性对照实验中，高甲硫氨酸下调HsDHS表达后菌株抑制效果显著增强，验证仪器可精准捕捉酶活性受抑制带来的生长缺陷；对比HsDHS与PvDHS菌株生长差值，可直接区分化合物是否仅靶向疟原虫DHS，完全排除化合物广谱细胞毒性干扰；全程自动化批量检测大幅降低人工误差，适合400分子规模高通量筛选，生长数据作为初筛指标快速缩小候选分子范围，后续再开展蛋白修饰、疟原虫体外实验深度验证。