Exploring Non-Saccharomyces yeasts from Daqu for beer production
大曲来源非酿酒酵母用于啤酒酿造的挖掘研究
期刊《LWT-Food Science and Technology》2024年第209卷，文章编号116803，DOI：10.1016/j.lwt.2024.116803，2024年9月21日在线发表
1 摘要总结
啤酒工业目前仅依靠酿酒酵母、巴氏酵母两类菌株，风味单一、产品创新受限；白酒大曲蕴含丰富非酿酒酵母，但其啤酒酿造潜力尚无系统探究。本研究从国内高、中、低温大曲中共分离80株、分属14种非酿酒酵母，系统完成胁迫耐受、絮凝、酚类异味生成、麦芽汁发酵与风味物质定量筛选；筛选优势菌株开展纯培养、与商业啤酒酵母US-05混合发酵，并完成感官评定。结果表明戴尔有孢圆酵母TD2是唯一可高效利用麦芽糖、麦芽三糖的菌株；异常威克汉姆酵母乙酸乙酯产量为US-05的13.86倍，高渗透压汉逊酵母苯乙醇乙酸产量提升7倍；与US-05共发酵不会降低酒精度与发酵度，但大幅提升酯、高级醇等香气物质，丰富啤酒果香层次。该研究证实大曲非酿酒酵母具备啤酒增香潜力，拓展啤酒发酵酵母资源，为特色精酿开发提供新思路。
2 中文关键词
大曲；非酿酒酵母；啤酒发酵；风味物质；混合发酵；胁迫耐受性
3 研究目的
1. 从多类型白酒大曲分离、分子鉴定非酿酒酵母菌株，建立大曲酵母资源库；
2. 系统评估全部菌株温度、乙醇、渗透压胁迫耐受能力，筛选酿造适配菌株；
3. 测定酵母絮凝能力、酚类异味（POF）生成特性，排除产生不良风味菌株；
4. 单菌麦芽汁发酵，定量糖化、酒精生成、各类挥发性香气物质，筛选高产香菌株；
5. 构建非酿酒酵母+商业啤酒酵母US-05同步混合发酵体系，分析理化与风味变化；
6. 20L放大酿造并开展专业感官评价，验证优势菌株实际啤酒生产应用价值。
4 研究思路
1. 大曲样品采集与酵母分离：收集国内高/中/低温大曲共18份，梯度稀释涂布YPD平板，纯化单菌落，扩增26S rRNA D1/D2区测序鉴定（附录表1）；
2. 胁迫耐受高通量检测：使用芬兰Bioscreen C分析仪，设置20/25/30/37℃、5%/10%乙醇、10%/15%/20%山梨醇渗透压梯度，测定各菌株最大生长速率（图1）；
3. 絮凝性能检测：采用ASBC标准吸光度法，按絮凝率分为无、中等、强絮凝菌株（图2、附录表2）；
4. 酚异味POF测定：阿魏酸底物培养，325nm吸光度判定是否生成丁香酚不良风味（图2、附录表3）；
5. 小规模纯麦芽汁发酵：13°P麦汁20℃发酵10d，HPLC检测残糖、酒精度、发酵度（图2、附录表4）；
6. HS-SPME-GC-MS定性定量高级醇、酯、有机酸等全部挥发性风味（图3）；
7. 混合发酵实验：50%非酿酒酵母+50%US-05同步接种，检测理化指标并对风味做PCA主成分分析（图4、表1）；
8. 20L罐放大酿造：筛选TD2、异常威克汉姆、高渗汉逊三类优势菌做单菌、混菌、双非酵母组合发酵；
9. 7人专业感官小组对成品啤酒果香、蜂蜜、溶剂、麦芽等维度打分（图6）；
10 整合生长、代谢、风味、感官数据，总结大曲酵母啤酒酿造应用潜力。
5 研究亮点
1. 首次大规模系统挖掘白酒大曲中非酿酒酵母的啤酒发酵潜力，一次性分离14种共80株菌株，扩充精酿酵母来源；
2. 高通量Bioscreen批量完成多梯度胁迫表型筛选，快速区分不同酵母温度、乙醇、渗透压耐受差异，高效初筛适配酿造菌株；
3. 筛选得到唯一可高效利用麦芽糖、麦芽三糖的戴尔有孢圆酵母TD2，单菌发酵酒精度接近商业酵母；
4. 发现异常威克汉姆、高渗汉逊酵母具备极强特征酯生成能力，分别大幅提升乙酸乙酯、苯乙醇乙酸含量；
5. 混合发酵体系不降低发酵效率与酒精度，仅富集果香类风味，无丁香等不良异味，工艺适配现有啤酒生产线；
6. 20L中试+专业感官验证，证明大曲酵母可直接用于特色果香型精酿啤酒工业化开发。
6 可延伸的研究方向
1. 优化分步接种混合发酵工艺，调控非酿酒酵母与US-05菌群生长时序，进一步提升特征香气；
2. 解析W. anomalus、H. osmophila高产酯合成关键酶基因，通过代谢工程强化风味物质生成；
3. 探究大曲酵母在不同麦汁浓度、发酵温度下风味物质变化，适配艾尔、拉格不同啤酒品类；
4. 开展菌株安全性毒理评价，明确食品级应用合规性；
5. 复配多株高香大曲酵母，开发无酿酒酵母纯特色发酵体系；
6. 追踪发酵全程菌群动态，解析共培养下菌株互作代谢调控机制。
7 测量数据、对应图表与研究意义
1. Bioscreen测定多胁迫下最大生长速率（图1）：直观对比14种酵母温度、乙醇、渗透压耐受差异，快速剔除酿造耐受差菌株，为菌株初筛提供定量高通量依据；
2. 菌株系统发育树+絮凝、POF、麦芽糖利用、酒精度汇总图（图2，附录表2/3/4）：一站式整合菌株基础酿造性状，快速锁定TD2、WA2、HO4三类优势菌株；
3. 单菌发酵挥发性风味热图（图3）：量化各类高级醇、酯含量差异，直观体现WA2高乙酸乙酯、HO4高苯乙醇乙酸特征；
4. 单/混合发酵PCA风味分簇图（图4）：证明单菌、混菌风味轮廓显著区分，混合发酵兼具US-05发酵优势与大曲酵母果香特征；
5. 混合发酵风味Z-score热图（图5、表1）：定量共发酵后各类酯、高级醇提升倍数，明确混香增益效果；
6. 8组中试啤酒感官雷达图（图6）：专业感官数据直观证明HO4/TD2混酿蜂蜜果香最优，WA2带来柑橘溶剂风味；
7. 20L发酵理化数据表（表2）：证实TD2单菌发酵残糖低、酒体完整，混酿酒精度、发酵度与市售酵母持平。
8 整体研究结论
1. 高、中、低温白酒大曲可分离得到14类非酿酒酵母，菌株间胁迫耐受、糖利用、产香能力差异极大；
2. 绝大多数大曲非酿酒酵母无法代谢麦芽糖/麦芽三糖，仅戴尔有孢圆酵母TD2可高效利用麦汁双糖，纯发酵即可达到72.8%表观发酵度；
3. 异常威克汉姆酵母高产乙酸乙酯，高渗透压汉逊酵母高含量生成苯乙醇乙酸，二者是核心增香菌株；仅威克汉姆、发酵毕赤酵母产生丁香酚类不良酚异味；
4. 大曲非酿酒酵母单独发酵酒精度偏低，但与US-05同步混合发酵后，发酵度、乙醇含量无显著下降，总酯、高级醇含量提升1.22–2.48倍；
5. 20L放大酿造感官结果显示，TD2+HO4混合发酵啤酒蜂蜜、果香得分最高，风味层次最丰富；
6. 白酒大曲来源非酿酒酵母是低成本、易获取的啤酒专用增香发酵菌株资源，适合特色精酿啤酒产业化开发。
9 芬兰Bioscreen仪器微生物生长曲线数据详细研究意义
本研究采用Bioscreen C高通量微生物分析仪，全程自动采集OD生长曲线，测定20/25/30/37℃、5%/10%乙醇、10%–20%山梨醇渗透压共7组胁迫条件下菌株最大生长速率，核心价值如下：
1. 高通量96孔同步检测80株酵母多胁迫梯度，替代平板终点定性实验，批量量化生长动力学差异，大幅缩短菌株耐受筛选周期；
2. 连续时序OD完整记录延迟期、对数期、稳定期，通过标准化最大生长速率定量区分耐受强弱，客观筛选适配啤酒发酵的耐乙醇、耐高糖菌株；
3. 统一恒温振荡密闭培养，消除人工分批摇瓶的温度、接种量操作误差，不同菌株、不同胁迫的数据具备横向统计学可比性；
4. 精准判定最适生长温度：绝大多数菌株30℃生长最优，膜毕赤酵母最适25℃，为啤酒发酵温控参数提供基础数据；
5. 区分乙醇耐受梯度：10%乙醇下库德毕赤、单孢卡氏酵母生长优势突出，提前预判高酒精度发酵适配菌株；
6. 高通量表型数据与后续麦芽汁发酵、GC-MS风味结果形成完整证据链，建立“胁迫耐受-发酵能力-风味产出”筛选逻辑，精准锁定中试优势菌株TD2、WA2、HO4。